米曲霉Aspergillus oryzae中单宁酶基因的克隆及其在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达

摘要

该论文以米曲霉Aspergillus oryzae的总DNA为模板,PCR扩增了单宁酶基因(tan),并分别尝试了利用大肠杆菌(Escherichia coli)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)进行表达.将单宁酶基因 tan重组到trc启动子控制下的表达载体pSE380中,并分别转化入大肠杆菌DH5α,Top10,BL21(DE3)三种重组表达菌株中.经1mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导12小时后,经过没食子酸丙酯紫外分光光度法测定,表明表达产物具有单宁酶活性,三个重组菌株的最高酶活力分别为65.50U/ml,61.02U/ml以及100.89U/ml.SDS-PAGE分析表明,在63KD处有明显的蛋白质特征带.将单宁酶基因tan重组到巴斯德毕赤酵母AOX基因启动子控制下的表达载体pPIC9k中,得到重组质粒pPIC9k-tan,转化到Pichia pastorisGS115菌株中,重组菌株经甲醇培养基诱导表达后,检测发酵液及菌体细胞中单宁酶酶活,与对照菌株相比,未发现明显活力.SDS-PAGE检测也未发现明显的特征带.

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

第二章单宁酶基因在大肠杆菌中的表达

2.1材料

2.2方法与步骤

2.3结果与分析

2.3.1总DNA的制备

2.3.2Tannase基因的克隆

2.3.3重组质粒Pse380-tan的构建

2.3.4重组质粒的PCR验证

2.3.5Tannase酶活性的测定及SDS-PAGE检测

2.4讨论

第三章单宁酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

3.1材料

3.2方法与步骤

3.3结果与分析

3.4讨论

第四章结论与展望

附录

参考文献

致谢