含GDNF基因的慢病毒载体的构建和其在人胚胎神经干细胞中的表达

摘要

利用含胶质源性神经营养因子(Glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)基因的慢病毒载体转染了人胚胎来源的神经干细胞,探讨了转染后GDNF在神经干细胞中的体外表达水平及其影响因素.首先GDNF基因被克隆入慢病毒载体,通过瞬时转染法包装出病毒上清,经滴度鉴定后分别按拷贝数为1、2.5、5、10转染神经干细胞.转染后细胞经过潮霉素筛选得到均一表达GDNF的神经干细胞体系.其后分别利用酶联免疫吸附(ELISA)方法和Real-timePCR方法测定不同转染组细胞在不同时间点GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平.实验中构建了表达GDNF基因的慢病毒载体,包装出的病毒上清在体外培养条件下成功转染了神经干细胞,经潮霉素筛选可以得到均一的持续表达分泌GDNF的人胚胎皮层神经干细胞体系.实验结果表明转染拷贝教可以影响GDNF的分泌水平,相同条件下转染拷贝教越高,GDNF分泌量越多,其基因表达水平越高.因此,含GDNF的慢病毒载体可以成功转染人胚胎来源的神经干细胞,使其持续表达GDNE转染过程中可以通过拷贝数在一定水平上控制GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平.