H-2Db四聚体的制备及其在检测LCMV特异性CD8+T细胞中的应用

摘要

MHC 四聚体技术是研究抗原特异性淋巴细胞应答的关键技术之一.为研究 H-2Db基因型(如 C57BL/6)小鼠的特异性CD8+T细胞免疫应答,需要建立H-2Db四聚体制备技术平台.首先以 RT-PCR 方法克隆 H-2Db重链基因的cDNA,进而构建 H-2Db胞外域与生物素化酶 BirA 底物肽(BSP)融合蛋白的表达载体,并在大肠杆菌中获得表达.在 LCMV GP33-41抗原肽(KAVYNFATC,KAV)和人β2-微球蛋白存在时,通过稀释法复性获得 H-2Db/KAV 单体.该单体经生物素化并纯化后与PE-链亲和素按4∶1的比例混合,即形成四聚体.通过流式细胞术检测经KAV肤免疫的C57BL/6小鼠体内的LCMV特异性CD8+T细胞的频率,结果表明在外周血、引流淋巴结和脾脏中均可检测到一定频率的 LCMV 特异性 CD8+T细胞,其中以对外周血标本染色的效果最佳.成功建立了小鼠 H-2Db四聚体制备技术平台,为监测及分析基于H-2Db基因型小鼠的实验性免疫治疗创造了条件.