HLA-Ⅰ类肽四聚体制备和用于特异性CTL检测的优化研究

摘要

背景和目的 T细胞是机体免疫系统最关键的细胞之一，研究T细胞的识别、活化及频数分布是现代免疫学基础研究及应用研究的一个最重要的环节。 细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes，CTL或cytotoxicTcells，Tc)在T细胞免疫应答中发挥重要作用，CTL主要识别存在于靶细胞(如病毒感染细胞或肿瘤细胞)表面的抗原多肽，这种识别受MHC-I类分子的限制。CTL的主要生物学作用为参与抗病毒免疫、抗肿瘤免疫及移植排斥反应。但CTL体外培养比较困难，扩增过程带来大量非抗原表位特异性的T细胞，缺乏精确分析抗原特异CTL的频数以及快速分离扩增这类细胞的技术。 在单个细胞水平研究抗原表位特异性T细胞是非常重要的。在过去，通常用铬51释放测定法和有限稀释分析法来测定抗原特异T细胞反应，但这两种方法耗时、费工、不敏感，而且不能在单个细胞水平上研究抗原特异性CTL。自从1996年Altma等发明了HLA-I类肽四聚体的方法后，使得抗原特异CTL的检测迈向了新的台阶，这个新方法更敏感，可以直接体外在单个细胞水平分析抗原特异T细胞，而不需体外扩增，这样对体内免疫反应提供了更精确的描述。 四聚体制备时需要先将单聚体生物素化，再与标记PE的链亲和素反应才能形成四聚体，步骤繁琐，价格昂贵。而且该技术是国外的专利，我们需要开发自己的专利，用抗体来交联单聚体形成多聚体，简化交联步骤，降低成本。由于卵黄抗体产量高，收集方便，我们决定制备抗HLA-I类分子的重链和轻链的卵黄抗体，尝试用于交联单聚体，形成抗体交联的HLA-I类肽多聚体。 由于抗原特异T细胞在外周血中的频数很低，用四聚体直接检测通常不到PBL的1％，难以达到统计处理的要求，而且较低频数的抗原特异CTL使对比和连续地评价不同病人的免疫功能非常困难。在临床上检测不同样本时，由于抗原特异CTL的百分比很低，很难看出差异，因此我们需要优化人外周血单个核细胞(PBMC)中的抗原特异CTL的检测，用我们设计的方法，用表位肽刺激PBMC使抗原特异T细胞的百分比增高。 方法 目的蛋白在原核系统中以包涵体的形式表达，将表达HLA-A*0201重链(Hc)和轻链(β2m)的工程菌优化表达，筛选了高表达目的蛋白的菌株进行发酵。 用三种不同的悬液与发酵后的表达HLA-A*0201重链(Hc)和轻链(β2m)的工程菌混匀，加入溶菌酶，冻存于-20℃，然后室温解冻，超声破菌。得到包涵体后，再用三种不同的方法来洗涤包涵体，最后溶于尿素溶液。对比三种处理方法的纯度和得率。 将溶于尿素的重链和轻链初步复性，用初步复性的重链和轻链与尿素溶解的重链和轻链，进行四种搭配，加入复性液，同时加入CMV特异的PP65肽(序列：NLVPMVATV)，复性制备单聚体。采用随机单位组设计资料的方差分析(two-wayANOVA)来分析四种复性方法对单聚体得率的影响，所用的统计软件为SPSS的Windows版本10.0。 用SDS-PAGE，ELISA，斑点ELISA方法鉴定过柱后的不同蛋白峰，将生物素化的单聚体与PE标记的链亲和素反应形成四聚体。 包涵体经过洗涤、变性、复性后，再过离子交换层析柱，得到纯化蛋白，用复性纯化的HLA-A*0201重链(Hc)和轻链(β2m)分别免疫八只产蛋鸡，用ELISA方法监测卵黄抗体的效价的动态变化，用四种不同的方法来纯化卵黄抗体，并进行了几种方法间得率、纯度、效价和工作耗时的对比。将纯化后的高效价卵黄抗体标记异硫氰酸荧光素FITC，用于人外周血PBMC的流式细胞仪检测，标记辣根过氧化物酶HRP用于细胞表面HLA-I类分子的斑点ELISA检测。用卵黄抗体交联单聚体尝试构建抗体多聚体。 将测定为HLA-A*0201型的献血员的外周血中的PBMC分离，用不同浓度NLVPMVATV肽组合IL-2诱导CMV特异CTL的增殖。培养11，15，18天时取样用制备的四聚体-PE和购买的CD8-FITC双标记后上流式细胞仪，检，测CMV特异CTL在外周血淋巴细胞(PBL)中的百分比。 结果 工程菌诱导表达后，重链在32kDa处有一条带，轻链在12kDa处有一条带，符合文献报道的结果。发酵后的重链和轻链表达量分别占菌体总蛋白的42％和49％，表达量较高。 用三种方法溶解发酵后的工程菌，洗涤包涵体，溶于尿素。结果表明第三种方法洗涤后包涵体的纯度最高，重链纯度达87％，轻链纯度达91％。1升低盐LB培养基发酵后至少能获得260mg初步复性的蛋白，而每次复性制备单聚体时只需初步复性的重链和轻链各12mg，因此260mg初步复性的蛋白能重复进行22次复性过程，保证了单聚体的产量。 用传统方法制备单聚体，200ml的复性体积只得到0.53mg单聚体，而用我们设计的新方法，先初步复性重链和轻链后再来折叠制备单聚体，在相同条件下得到了2.1mg单聚体，产量大大提高。统计结果表明新方法对比传统方法有统计学差异。多重比较的结果表明四种复性方法之间均有显著性差异，P＜0.05，用初步复性的Hc和β2m制备单聚体得率最高。 经鉴定，过柱后的四个蛋白峰依次为重链聚合体，单聚体，轻链和肽。 包涵体洗涤、变性、复性后过DEAESepheroseFastFlow离子交换层析柱后，重链纯度达92％，轻链纯度达95％。用纯化的重链和轻链分别免疫8只产蛋鸡，免疫后八只鸡的IgY效价增加明显，卵黄抗体抗重链Hc的效价从102增加到1053，卵黄抗体抗轻链β2m的效价从101增加到104.7。四种纯化卵黄抗体的方法各有优缺点，CA-AS-1法获得的抗体纯度最高，达95％，但得率最低，为1.2mg/ml卵黄。 标记了异硫氰酸荧光素FITC的卵黄抗体能与表达在PBMC上的HLA-I类分子结合，用于流式细胞仪检测。标记了辣根过氧化物酶HRP的卵黄抗体能与点在硝酸纤维素膜上的PBMC结合，显色形成明显斑点。而与低表达HLA-I类分子的T2细胞和不表达HLA-I类分子的K562细胞无反应，不形成明显斑点。卵黄抗体交联单聚体后，仍存在一些游离的抗体，直接与PBMC结合，不能用于抗原特异T细胞的检测，今后的研究重点在于去除游离的抗体，形成稳定的抗体多聚体，必要时用交联剂固定，用于特异T细胞的检测。用相应的四聚体来检测CMV特异CTL，从流式图可看出，50μg/mlNLVPMVATV肽是诱导CMV特异CTL的最佳浓度，在体积为100μl时只需加肽5μg，刺激2小时后，再培养15天时，CMV特异CTL的百分比最高，达19.9％，占CD8+细胞的38％。CMV特异CTL可维持较高的百分比达18天，为18.56％，占CD8+细胞的42％。 结论 四聚体用新方法复性得率大大提高，解决了四聚体制备中的瓶颈问题，降低了成本。四聚体可用于相应的抗原特异T细胞检测，为临床治疗和用药提供有效的指导。在过去观察T细胞中的这小群抗原特异CTL一直是非常麻烦和耗时的，四聚体这个新技术的应用使得这群细胞的体外检测成为可能，有较大的应用价值。这部分的相关内容已发表在JournalofImmunologicalMethods，SCI的影响因子为2.464。 用我科的专利技术洗涤包涵体，变性，复性后，为下一步过柱纯化打下了基础。由于包涵体的前期处理工艺较好，目的蛋白纯度较高，使后期纯化困难减小。由于进化的差别，鸡的IgY能与哺乳动物抗原的更多表位发生反应，而引起一个放大的信号。鸡能用来研究一些高度保守的蛋白，这些蛋白在哺乳动物宿主免疫原性较差，但用鸡作为宿主能产生卵黄抗体。我们的实验表明，鸡能对人有核细胞表面的分子产生有效免疫。通过几种纯化方法的对比，我们解决了卵黄抗体纯化难的问题，为今后更好地研究和利用这个产量极高，收集方便的多克隆抗体提供了理论和技术的指导。这部分的相关内容已发表在ProteinExpressionandPurification，SCI的影响因子为1.336。 到目前为止，在体外产生充足数量的CMV特异CTL用于过继性细胞免疫治疗仍然是非常困难的任务。我们通过不断改进，将体外频数较低的这群细胞扩增到占CD8+T细胞的40％以上，为今后CMV特异CTL回输治疗巨细胞病毒感染提供了新的方法和思路。 综上所述，我们用基因工程方法表达了HLA-A*0201重链(Hc)和轻链(β2m)，并应用它们制备了用于抗原特异CTL检测的四聚体，用我们设计的新方法复性制备单聚体，使得率大大提高，为下一步临床应用四聚体检测抗原特异CTL提供了充足的检测试剂。制备了抗HLA-A*0201重链(Hc)和轻链(β2m)的卵黄抗体，制备的卵黄抗体标记了FITC和HRP后，能成功地用于PBMC表面的HLA-I类分子的检测。但卵黄抗体用于构建抗体多聚体的方法仍需进一步探索和研究，研究的重点在于形成稳定的抗体多聚体，抗体交联后要去除游离抗体，必要时加交联剂固定。另外，我们用CMV的特异的PP65肽表位NLVPMVATV组合IL-2将HLA-A*0201型供者的外周血CMV特异CTL诱异到达CD8+细胞的40％以上，为CMV特异CTL回输治疗巨细胞病毒感染的过继性细胞免疫治疗方案提供了方法和思路。该方法也可用于刺激培养病人的PBMC，再用四聚体检测，使频数较低的抗原特异CTL基数提高，更好地对比不同病人的特异CTL的频数。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章 HLA-Ⅰ类肽四聚体制备的优化和改进

第二章抗HLA-A*0201α链和β2m的卵黄抗体的制备和应用

第三章 PBMC中的抗原特异CTL检测和诱导的优化

全文总结

主要英文缩略词表

第四章 综述

成果

致谢