HLA-结合肽，和编码所述HLA-结合肽的DNA片段以及重组载体

摘要

本发明提供了结合至HLA-A类型分子的HLA-结合肽，所述HLA-结合肽包含选自由SEQ ID NOS：1至80组成的组的至少一种类型的氨基酸序列，并且由不小于8且不大于11个氨基酸残基组成。在这里提到的全部这些氨基酸序列是利用某些主动学习方法用预测程序预测的结合至人HLA-A类型分子的氨基酸序列。

说明书

技术领域

本发明涉及HLA-结合肽，并且涉及编码所述HLA-结合肽的DNA片段以及重组载体。

背景技术

当对于癌细胞是特异性的癌症抗原存在于癌细胞表面上时，有时当作为癌细胞被识别为对于自身的外来物质的结果的先天免疫反应进行时，并且随后诱导特异性免疫应答，因而引起消除所述癌细胞的反应。

当诱导特异性免疫应答时，通过中和抗体消除体液中癌细胞来源的片段等，并且由细胞毒素T淋巴细胞(CTLs)消除癌细胞自身。即，CTL特异性识别存在于癌细胞表面上的HLA类别I分子中的由8至11个氨基酸组成的癌症抗原(CTL表位)，并且通过破坏癌细胞而消除癌症。因此，至关重要的是识别这样一种癌症-特异性的CTL表位，以便开发用于癌症的治疗疫苗。

该种类的技术是从专利公布1知道的。专利公布1指出，由特定的氨基酸序列形成的寡肽具有结合到HLA的性质。

[专利公布1]日本专利申请公开号H8-151396(1996)

发明内容

然而，上述公布中描述的常规技术关于下列要点具有改善的空间。

首先，不清楚上述公布的HLA-结合肽是否有效结合至HLA分子，并且关于HLA-结合肽的性质仍存在改善空间。

其次，表明了上述公布的HLA-结合肽具有结合至HLA-DQ4的性质。然而，不清楚它是否结合到欧洲和美国人中经常见到的HLA-A2分子(HLA-A*0201基因的产物等)，以及是否结合到日本人中经常见到的HLA-A24分子(HLA-A*2402基因的产物等)。在上述情况下实现了本发明，并且其目的是提供当结合至特定类型的HLA分子时显示高度亲和性的HLA-结合肽。

根据本发明，提供结合至HLA-A类型分子的HLA-结合肽，所述HLA-结合肽包含选自由SEQ ID NOS：1至80组成的组的至少一种类型的氨基酸序列，并且由不小于8且不大于11个氨基酸残基组成。

而且，根据本发明，提供包含选自由SEQ ID NOS：1，2，6，21，23，44，和61组成的组的至少一种类型氨基酸序列的HLA-结合肽。

而且，根据本发明，提供结合至HLA-A类型分子的HLA-结合肽，所述HLA-结合肽含有由包含上述HLA-结合肽的氨基酸序列的一个或两个氨基酸残基的缺失、置换、或加入形成的氨基酸序列，并且由不小于8且不大于11个氨基酸残基组成。

以这种方法，含有由具有结合至HLA-A类型分子性质的特定氨基酸序列的氨基酸残基的缺失、置换、或添加而形成的氨基酸序列的构造还可以显示类似于上述HLA-结合肽的效果。

而且，根据本发明，提供含有编码上述HLA-结合肽的DNA序列的DNA片段。

而且，根据本发明，提供含有编码上述HLA-结合肽的DNA序列的重组载体。

而且，根据本发明，提供在哺乳动物体内变成上述HLA-结合肽的HLA-结合肽前体。

如上说明了本发明的构造，但是这些构造的任何组合也有效作为本发明实施方案。而且，本发明的表达转化成另一类别也有效作为本发明的实施方案。

依照本发明，因为它包括特定的氨基酸序列，所以可以获得在结合至HLA-A类型分子中具有优异性质的HLA-结合肽。

附图简述

从下面通过参考附图说明的优选实施方案，上述目的、其它目的、特征、和优势将变得更显而易见。

[图1]用于解释实施方案中使用的主动学习实验设计的示意图。

实施本发明的最佳方式

在下面通过参考附图说明用于实施本发明的方式。在全部附图中，相同的构成元件由相同的参考数字和符号表示，以便不会重复解释。

实施方案1

在该实施方案中，将含有氨基酸序列的肽用作HLA-结合肽的候选物，通过利用主动学习实验方法(日本专利申请公开号H11-316754(1999))获得的假设所预测，所述氨基酸序列依据-logKd值是3或更大地结合至HLA分子，并且由不小于8且不大于11个氨基酸残基组成。作为结合实验的结果，已经证实这些肽实际是HLA-结合肽。

结果，可以有效获得许多HLA结合肽，所述HLA结合肽在结合至HLA-A类型分子中具有优异性质，因为它们含有依据-logKd值是3或更大的结合至HLA分子的氨基酸序列。

具体而言，与该实施方案相关的HLA-结合肽是结合至HLA-A类型分子的HLA-结合肽，含有选自由将随后描述的SEQ ID NOS：1至80组成的组的至少一种类型的氨基酸序列，并且由不小于8且不大于11个氨基酸残基组成。

在人HLA-A类型之中，约50％的日本人具有HLA-A24类型。许多欧洲和美国人，诸如德国人，具有HLA-A2类型。

在这里提到的全部这些序列是由包含在癌症抗原存活蛋白(GenBankAF077350、BC008718、BC034148、BC065497、HSU75285、AY95969)和它的剪接变体存活蛋白2B(GenBank AB028869)的基因产物中的9个氨基酸残基或10个氨基酸残基组成的序列。

在下面表1和表2中给出了SEQ ID NOS：1至40的9-氨基酸肽序列。

表1

HLA-A24-结合的9氨基酸肽

  SEQ ID No    20个最高预测    分数    预测分数    SEQ名称    结合实验数据  1    TLPPAWQPF    6.7882    5    8.2648  2    AFLSVKKQF    6.0879    108    7.7283  3    DLAQCFFCF    5.739    53  4    NEPDLAQCF    5.6903    50  5    HRISTFKNW    5.6859    17  6    GAPTLPPAW    5.5929    2    6.1588  7    SVKKQFEEL    5.0665    111  8    KVRRAIEQL    5.0567    153  9    QCFFCFKEL    4.9164    56  10    ISTFKNWPF    4.9109    19  11    LTLGEFLKL    4.8292    119  12    EELTLGEFL    4.7307    117  13    KKHSSGCAF    4.7119    101  14    LKDHRISTF    4.7103    14  15    LPPAWQPFL    4.6089    6  16    EFLKLDRER    4.5337    123  17    RAIEQLAAM    4.4903    156  18    STFKNWPFL    4.4592    20  19    PFLKDHRIS    4.4049    12  20    EPDLAQCFF    4.3935    51

表2

HLA-A24-结合的9氨基酸肽

  SEQ ID No    20个最高预测    分数    预测分数    SEQ名称    结合实验数据  21    SSGCAFLSV    4.7757    104    5.29472  22    RMAEAGFIH    4.5561    37  23    TLPPAWQPF    4.4459    5    5.3599  24    DLAQCFFCF    4.3216    53  25    SVKKQFEEL    4.3071    111  26    TLGEFLKLD    4.2633    120  27    FLEGCACTP    4.1919    27  28    LTLGEFLKL    4.1361    119  29    EFEETAKKV    4.0951    146  30    GAPTLPPAW    4.0189    2  31    FKNWPFLEG    4.0011    22  32    FLKDHRIST    3.9909    13  33    KQFEELTLG    3.9869    114  34    KVRRAIEQL    3.9465    153  35    EELTLGEFL    3.9308    117  36    AFLSVKKQF    3.9207    108  37    LPPAWQPFL    3.9118    6  38    AEAGFIHCP    3.9017    39  39    RAIEQLAAM    3.8884    156  40    NEPDLAQCF    3.8797    50

在下面表3和表4中给出了SEQ ID NOS：41至80的10-氨基酸肽序列。

表3

HLA-A24-结合的10氨基酸肽

  SEQ ID No    20个最高预测    分数    预测分数    SEQ名称    结合实验数据  41    TLPPAWQPFL    6.4239    5  42    DHRISTFKNW    6.0842    16  43    NEPDLAQCFF    6.0416    50  44    FLKDHRISTF    5.9714    13    7.00797  45    RISTFKNWPF    5.7621    18  46    QFEELTLGEF    5.7396    115  47    PTLPPAWQPF    5.6581    4  48    ENEPDLAQCF    5.6356    49  49    AQCFFCFKEL    5.4317    55  50    PDLAQCFFCF    5.3503    52  51    ELTLGEFLKL    5.2479    118  52    HCPTENEPDL    5.0979    45  53    HKKHSSGCAF    5.0665    100  54    RMAEAGFIHC    4.9796    37  55    ISTFKNWPFL    4.9264    19  56    MGAPTLPPAW    4.8622    1  57    FFCFKELEGW    4.8526    58  58    VAYACNTSTL    4.8355    79  59    LSVKKQFEEL    4.8327    110  60    PFLEGCACTP    4.7885    26

表4

HLA-A24结合的10氨基酸肽

  SEQ ID No    20个最高预测    分数    预测分数    SEQ名称  结合实验数据  61    FLKDHRISTF    4.9449    13  5.5304  62    TLPPAWQPFL    4.7647    5  63    KEFEETAKKV    4.5657    145  64    VAYACNTSTL    4.5599    79  65    ELTLGEFLKL    4.5004    118  66    LSVKKQFEEL    4.4975    110  67    HSSGCAFLSV    4.4888    103  68    DDDPIGPGTV    4.4859    70  69    STLGGRGGRI    4.3471    86  70    TLGEFLKLDR    4.3276    120  71    RMAEAGFIHC    4.2842    37  72    YACNTSTLGG    4.2791    81  73    AQCFFCFKEL    4.2702    55  74    MAEAGFIHCP    4.254    38  75    FLEGCACTPE    4.2239    27  76    DDPIGPGTVA    4.2078    71  77    WQPFLKDHRI    4.1939    10  78    ELEGWEPDDD    4.1426    63  79    FEELTLGEFL    4.1228    116  80    AEAGFIHCPT    4.117    39

SEQ ID NOS：1至40的序列是由包含在癌症抗原存活蛋白的某一基因组蛋白质中9个氨基酸残基组成的序列。

SEQ ID NOS：1至20的序列是由上述方法依据结合至HLA-A24分子预测是20个最高的序列。SEQ ID NOS：1至20以递减结合次序排列。即，SEQ ID NO：1是预测具有最好结合的序列。对于结合至HLA-A24分子的预测分数和每个序列的结合实验数据以-logKd值的形式表达。

而且，SEQ ID NOS：21至40的序列是由上述方法依据结合至HLA-A2分子预测是20个最高的序列。SEQ ID NOS：21至40以递减的结合次序排列。即，SEQ ID NO：21是预测具有最好结合的序列。对于结合至HLA-A2分子的预测分数和每个序列的结合实验数据以-logKd值的形式表达。

SEQ ID NOS：41至80的序列是由10个包含在癌症抗原存活蛋白某一基因组蛋白质中的氨基酸残基组成的序列。

SEQ ID NOS41至60的序列是由上述方法依据结合至HLA-A24分子预测是20个最高的序列。SEQ ID NOS：1至20以递减结合次序排列。即，SEQ ID NO：41是预测具有最好结合的序列。对于结合至HLA-A24分子的预测分数和每个序列的结合实验数据以-logKd值的形式表达。

而且，SEQ ID NOS：61至80的序列是由上述方法依据结合至HLA-A2分子预测是20个最高的序列。SEQ ID NOS：61至80以递减的结合次序排列。即，SEQ ID NO：61是预测具有最好结合的序列。对于结合至HLA-A2分子的预测分数和每个序列的结合实验数据以-logKd值的形式表达。

虽然随后描述详细资料，但是清楚的是，在预测分数和结合实验数据之间存在相关性。即，虽然有轻微的误差，但是可以说，实验发现，由上述方法预测对于HLA分子具有高度结合的肽具有对于HLA分子的高度结合。

因为没有常规技术通过利用这样一个实验设计方法用于发现HLA-结合肽，所以仅有非常小数量的HLA结合肽已经实验证实具有HLA-结合性质。因为这个，即使当通过常规方法随机合成由9个氨基酸或10个氨基酸残基组成的肽并进行实验以发现它是否结合至HLA分子时，依据-logKd值超过6，存在仅约为百分之一的可能性发现具有结合的一种。

依照这个实施方案，因为使用了通过利用实验设计方法发现HLA-结合肽的技术，如上所述，可以发现多达80个HLA结合肽的序列。而且，当实验检验所获得的一些HLA结合肽的结合时，证实全部序列已经进行实验，对于HLA显示优异的结合，等于或高于预测的结合。

在这些序列中，实验证实含有选自由SEQ ID NOS：1，2，6，21，23，44，和61组成的组的至少一种类型氨基酸序列的LA-结合肽结合至人HLA-A类型分子。因此可以确定地说，它是对于人HLA-A类型分子结合具有优异性质的HLA-结合肽。

依据-logKd值，与本实施方案相关的对于所述HLA-结合肽的HLA分子的结合是3或更大，特别优选5或更大，并且更优选5.4或更大。

在生物化学领域，已知依据-logKd值约为3的结合能力是肽是否实际结合至MHC的阈值水平。因此，如果对于HLA分子的结合依据-logKd值是3或更大的，则可以说它是HLA-结合肽。

而且，如果对于HLA分子的结合依据-logKd值是5或更大，因为获得的肽在结合至HLA分子中具有优异性质，则它可以适合地用于开发用于免疫疾病等的有效治疗药物、预防药物等。

而且，如果对于HLA分子的结合依据-logKd值是5.4或更大，则获得的肽在结合至HLA分子中具有特别好的性质，并且它可以适合地用于开发用于免疫疾病等的更有效的治疗药物、预防药物等。

而且，可以安排的是，与本实施方案相关的HLA-结合肽由不小于8且不大于11个氨基酸残基组成。

以这种方法，如果所述肽由不小于8且不大于11个氨基酸残基组成，则它在结合至HLA分子中具有优异的性质。而且，细胞毒素T淋巴细胞(CTL)特异性识别对于癌细胞(CTL表位)是特异性的癌症抗原，并且通过仅破坏所述癌细胞而消除癌细胞，所述癌症抗原由存在于癌细胞表面上HLA类别I分子中的8至11个氨基酸组成。重要的是制备这样一种由8至11个氨基酸组成的对于癌细胞等是特异性的CTL表位，以便制备针对癌症等的治疗或预防用的疫苗。

例如，上述HLA-结合肽可以是由氨基酸残基单独组成的肽，但是它不特别限制于此。例如，只要不削弱本发明的效果，它可以是任选用糖链或脂肪酸基团等修饰的HLA-结合肽前体。将这样一种前体进行变化，包括在有生命的哺乳动物身体诸如人消化器官中通过消化酶等的消化而成为HLA-结合肽，因而显示类似于上述HLA-结合肽所显示的那些效果。

而且，上述HLA-结合肽可以是结合至人HLA-A24分子的肽。

而且，上述HLA-结合肽可以是结合至人HLA-A2分子的肽。

依照这个构造，因为从结合至HLA-A24分子获得肽，其经常见于亚洲人中，诸如日本人，所以可以将其用于对亚洲人诸如日本人是特别有效的治疗药物、预防药物等的开发中。

而且，依照这个构造，因为从结合至HLA-A2分子获得肽，其经常见于除日本人之外的欧洲和美国人中，所以可以将其用于对除日本人之外的欧洲和美国人是特别有效的治疗药物、预防药物等的开发中。

包含在上述HLA-结合肽中的氨基酸序列可以是由癌症抗原存活蛋白蛋白质获得的氨基酸序列，但是它不特别限制于此。例如，它可以是由HIV蛋白质获得的氨基酸序列，或者是由雪松花粉蛋白质获得的氨基酸序列，等等。而且，它可以含有由具有其它致病性或变应原性的蛋白质获得的氨基酸序列。

实施方案2

依照该实施方案，提供结合至HLA-A类型分子的HLA-结合肽，所述HLA-结合肽含有由上述HLA-结合肽中包含的氨基酸序列的一个或两个氨基酸残基的缺失、置换或者添加形成的氨基酸序列，并且由不小于8且不大于11个氨基酸残基组成。

如随后所述，即使所述构造包括由结合至HLA-A类型分子的特定氨基酸序列的一个或一些氨基酸残基的缺失、置换、或添加形成的氨基酸序列，也显示类似于与上述实施方案1相关的HLA-结合肽的那些效果。

即，可以预测，即使由显示在SEQ ID NOS：1至80中的在结合至HLA-A分子中具有优异性质的氨基酸序列的一个或两个氨基酸残基的缺失、置换、或添加而形成的氨基酸序列也将以类似方式显示优异的HLA-结合性质。

从另一个观点，可以预测，即使由通过上述方法预测在结合至HLA-A分子中具有优异性质的氨基酸序列的一个或两个氨基酸残基的缺失、置换、或添加而形成的氨基酸序列也将以类似方式显示优异的HLA-结合性质。取代的氨基酸残基优选是具有相互类似性质的氨基酸残基，诸如都是疏水性氨基酸残基。

而且，可以利用为本领域技术人员所知的方法产生实施方案1和实施方案2中描述的HLA结合肽。例如，它们可以通过固相方法或液相方法人工合成。备选地，可以通过从编码这些HLA结合肽的DNA片段或重组载体表达它们而产生这些HLA结合肽。因而可以通过为本领域技术人员已知的方法识别所获得的这些HLA结合肽。例如，可以通过利用Edman降解、质谱法等识别。

实施方案3

依照本实施方案，提供含有编码上述HLA-结合肽的DNA序列的DNA片段。因为与本实施方案相关的DNA片段含有特定的DNA序列，所以它可以表达上述HLA-结合肽。

当上述HLA-结合肽通过利用与本实施方案相关的DNA片段表达时，可以通过将该DNA片段结合到细胞中进行表达，或者可以通过利用商业的人工蛋白质表达试剂盒进行表达。

而且，可以通过将上述DNA片段结合到例如人细胞中进行连续表达。因为这个，可以通过将编码HLA-结合肽的DNA片段结合到所述细胞中而不是将HLA-结合肽本身结合到所述细胞中使HLA-结合肽连续存在于细胞之内。当将HLA-结合肽用作疫苗时，根据增强疫苗功效，这样一种连续表达能力是有利的。

而且，与本实施方案相关的DNA片段可以通过本领域技术人员已知的方法产生。例如，它可以借助于商业的DNA合成仪等人工合成。备选地，它可以是通过利用限制酶等来自存活蛋白基因的片段。备选地，它可以通过利用引物的PCR方法从存活蛋白基因扩增。可以利用本领域技术人员已知的方法识别由此获得的DNA片段。例如，可以通过商业的DNA序列分析仪识别。

实施方案4

依照本实施方案，提供含有编码上述HLA-结合肽的DNA序列的重组载体。因为与本实施方案相关的重组载体含有特定的DNA序列，所以可以表达上述HLA-结合肽。

当上述HLA-结合肽通过利用与本实施方案相关的重组载体表达时，可以通过将该重组载体结合到细胞中进行表达，或者可以通过利用商业的人工蛋白质表达试剂盒进行表达。

而且，可以通过将上述重组载体结合到例如人细胞中进行连续表达。因为这个，可以通过将编码HLA-结合肽的重组载体结合到所述细胞中而不是将HLA-结合肽本身结合到所述细胞中使HLA-结合肽连续存在于细胞之内。当将HLA-结合肽用作疫苗时，根据增强疫苗功效，这样一种连续表达能力是有利的。

而且，在上述重组载体中，可以通过利用调控区域中参与转录和表达的某一序列高精密度地控制表达的HLA-结合肽的量，所述序列诸如编码上述HLA-结合肽的DNA序列的启动子区域上游。而且，可以通过利用参与复制的调控区域诸如重组载体起始区域中的某一序列高精密度地控制细胞中的重组载体拷贝数。

而且，上述重组载体可以自由含有除编码上述HLA-结合肽的DNA序列以外的序列。例如，它可以含有标记基因诸如耐药基因的序列。

而且，与本实施方案相关的DNA片段可以利用本领域技术人员已知的方法产生。例如，它可以通过在某一限制酶位点切割商业载体诸如pBR322或pUC19的多克隆位点，并将上述DNA片段插入到所述位点并进行连接。而且，可以利用本领域技术人员已知的方法识别由此获得的重组载体。例如，可以通过琼脂糖凝胶电泳证实由预定的限制酶切割的DNA片段的长度是否符合商业载体诸如pBR322或pUC19的限制性酶切图，而且，可以将其通过DNA序列分析仪等识别上述DNA序列是否包含在从多克隆位点切去的DNA序列中。

如上说明了本发明的构造，但是这些构造的任何组合作为本发明实施方案也是有效的。而且，本发明的表达转化成另一类别也有效作为本发明的实施方案。

例如，在上述实施方案中，可以采用含有由癌症抗原存活蛋白的某一基因组蛋白质(SEQ ID NO：81)获得的氨基酸序列的HLA-结合肽，而不是除存活蛋白以外的病原体诸如HIV病毒的HLA-结合肽，可以采用含有由蛋白质诸如雪松花粉变态反应原等获得的氨基酸序列的HLA-结合肽。

以这种方式，如果包含由上述方法预测具有优异HLA-结合性质的氨基酸序列，则当实验上进行确认时，可以预期它将以类似方式显示优异的HLA-结合性质。因为这个，这些HLA结合肽可以适合地主要用于传染病(流形性感冒、SARS、HIV、HCV等)，以及癌症免疫治疗、变态反应疾病(花粉变态反应(花粉症)、风湿病、遗传性过敏症、哮喘等)、自身免疫疾病等的治疗或预防。

实施例

通过参考实施例将本发明进一步说明如下，但是本发明不限于此。

具体地，本实施例中的预测、实验和评价的程序是基于主动学习实验设计进行的，并通常重复下列步骤。这里采用的主动学习实验设计的示意图显示在图1中。

(1)将随后描述的更低的级别的学习算法的试验进行一次。即，通过从积累的数据随机采样而产生多个假设，关于随机表达的选择物查询点(肽)，选择显示预测值最大分布的点作为进行实验的查询点。

(2)通过将随后描述的合成和纯化方法制备在所选择的查询点的肽，并通过将随后描述的实验测量真实的结合能力，并加入到积累的数据。

在本实施例中，作为更低级别的学习算法，使用Hidden Markov Model的指导学习算法，并且通过用223个类型的肽的初始数据出发每一实验预测并选择20至30个类型的肽；将上述程序重复四次，并且获得总共341个数据点。

更具体而言，在本实施例的主动学习方法中，每一实验设计和合成含有氨基酸序列的20至30个类型的肽，在所述氨基酸序列中安排20种类型氨基酸的9种。测量其对于HLA分子的结合强度(结合能力)。作为实验结果，获得所述结合能力(以摩尔浓度形式的Kd值)。当结合能力高时，选择所述肽作为可以用作疫苗材料的HLA-结合肽的选择物。

将由此获得的结果输入到装有采用Hidden Markov Model作为数学算法的学习机的学习系统中，并发生规则。学习机抽样不同的结果以制备所述规则。通过学习机表达的规则具有不同的构造。当需要作为积累数据时，存储由此获得的规则和实验数据。

从大于20⁹＝5000亿个肽序列之中，通过所述规则选择随后实验的选择物，并重复上述方法。在这个阶段中，将不同规则应用于实验选择物，并且将划分实验结果预测的选择物进行实验。以这种方法，因为将划分实验结果预测的选择物进行随后的实验，所以最终的预测精密度增加。

以这种方法，多个学习机进行选择性采样，其中将产生不同预测的样品选择作为实验选择物，可以有效得到信息，并且可以高精密度地获得假设(规则)。将上述方法重复四次，得到如随后所述实施例中的优异结果。将它重复七次或更多次而给出更好的结果。

依照这样一个主动学习方法，可以减少对于由9个氨基酸残基组成的肽的结合实验的重复次数，否则，对于全部HLA结合肽选择物的5000亿或更多的组合，将不得不进行所述结合实验。在主动学习方法中，由实验形成规则，并且对于通过应用所述规则而预测的数十个序列选择物重复所述实验。因为这个，可以削减实验数量，并且可以大大减少初始筛选的时间和成本。

而且，通过主动学习方法，由所述规则将肽结合至HLA的预测的命中率达到70至80％，而其它已知技术诸如锚固法(anchor method)的命中率低至30％。

肽的合成和纯化

利用Fmoc氨基酸通过Merrifield固相方法人工合成肽。在去保护后，利用C18柱进行反相HPLC纯化以产生95％或更高的纯度。利用MALDI-TOF质量分光计(Voyager DE RP，PerSeptive)进行肽的鉴定及其纯度确定。通过Micro BCA测定(Pierce Corp.)利用BSA作为标准蛋白质进行所述肽的定量分析。

将肽结合至HLA-A24分子的实验

利用表达HLA-A24分子的C1R-A24细胞(细胞由熊本大学的Masafumi Takiguchi教授制备，由Ehime大学的助理教授Masaki Yasukawa在许可下提供)测量肽对于作为HLA-A*2402基因产物的HLA-A24分子结合的能力。

首先将C1R-A24细胞在pH为3.3的酸性条件暴露30秒，由此离解并去除与HLA类别I分子共同缔合的轻链β2m、以及最初结合至HLA-A*2402分子的内源肽。在中和以后，将纯化的β2m加入到C1RA24细胞，将获得的产物加入到肽的连续稀释物，并在冰上温育4小时。利用识别在温育期间再缔合的三个成分即HLA-A*2402分子、所述肽和β2m的缔合(MHC-pep)的荧光标记的单克隆抗体17A12进行染色。

随后，利用FACScan荧光-激活细胞分选仪(Becton DickinsonBiosciences)定量测量每一个C1R-A24细胞(与上述荧光抗体的荧光强度成比例)的MHC-pep数目。通过公布的方法(Udaka等，Immunogenetics，51，816-828，2000)由每一细胞的平均荧光强度计算HLA-A24分子和所述肽之间的结合离解常数Kd值。

将肽结合至HLA-A2分子的实验

利用表达HLA-A*0201的细胞株JY细胞测量肽结合至作为HLA-A*0201基因产物的HLA-A2分子的能力。

首先将JY细胞在pH为3.8的酸性条件暴露30秒，由此离解并去除与HLA-A*0201分子非共价缔合的轻链β2m和内源肽。在中和以后，进行再缔合实验。

将上述JY细胞和纯化的β2m加入到将要测量结合能力的肽的逐步稀释物，并将温育在冰上进行4小时。将已经再缔合到该点的HLA-A*0201分子利用缔合类型的特定荧光标记的单克隆抗体BB7.2染色。

随后，利用流式细胞计测量每一细胞的荧光量并通过公布的方法(Udaka等，Immunogenetics，51，816-828，2000)计算以摩尔浓度形式的离解常数Kd值。

评价结果

获得了显示在上述表1至4中的预测结果和实验结果。

表1和表2中的SEQ ID NOS：1至40的序列是由包含在GenBank中注册的存活蛋白的某一蛋白质的全长度序列中的9个氨基酸残基组成的序列。

而且，SEQ ID NOS：1至20的序列是通过假设按照对于HLA-A24分子的结合而预测是20个最高的序列，所述假设通过实施方案1中说明的实验设计方法获得。SEQ ID NOS：1至20以递减结合次序排列。即，SEQ ID NO：1是预测具有最好结合的序列。

而且，SEQ ID NOS：21至40的序列是通过假设按照对于HLA-A24分子的结合而预测是20个最高的序列，所述假设通过实施方案1中说明的实验设计方法获得。SEQ ID NOS：21至40以递减的结合次序排列。即，SEQ ID NO：21是预测具有最好结合的序列。

存活蛋白的某一蛋白质的全长度氨基酸序列显示在SEQ ID NO：81中(MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIGPGTVAYACNTSTLGGRGGRITREEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETAKKVRRAIEQLAAMD)。

表1和表2各自显示在利用上述预测程序获得的预测结果中20个最高分数的氨基酸序列、预测分数和相应的结合实验数据。通过上述合成方法人工合成存活蛋白的肽序列而获得全部结合实验数据。

表3和表4中的SEQ ID NOS：41至80的序列由包含在GenBank中注册的存活蛋白的某一蛋白质的全长度序列中的10个氨基酸残基组成的序列。

而且，SEQ ID NOS：41至60的序列是通过假设按照对于HLA-A24分子的结合而预测是20个最高的序列，所述假设通过实施方案1中说明的实验设计方法获得。SEQ ID NOS：41至60是以递减结合次序排列的。即，SEQ ID NO：41是预测具有最好结合的序列。

而且，SEQ ID NOS：61至80的序列是通过假设按照对于HLA-A2分子的结合而预测是20个最高的序列，所述假设通过实施方案1中说明的实验设计方法获得。SEQ ID NOS：61至80以递减的结合次序排列。即，SEQ ID NO：61是预测具有最好结合的序列。

存活蛋白的某一蛋白质的全长度氨基酸序列显示在SEQ ID NO：81中。

表3和表4各自显示在利用上述预测程序获得的预测结果中20个最高分数的氨基酸序列、预测分数和相应的结合实验数据。通过上述合成方法人工合成存活蛋白的肽序列而获得全部结合实验数据。

可以预测，任何一种由一个或两个氨基酸残基相互置换形成的肽序列将对于HLA-A分子显示优异的结合。总之，即使也可以预测由显示在SEQID NOS：1至80中的在结合至HLA-A分子中具有优异性质的氨基酸序列的一个或一些氨基酸残基的缺失、置换、或添加而形成的氨基酸序列，也类似地显示优异的HLA-结合性质。

从另一个观点，甚至由假设类似预测的在结合至HLA-A分子中具有优异性质的氨基酸序列的一个或一些氨基酸残基的缺失、置换、或添加而形成的氨基酸序列也可以说显示优异的HLA-结合性质，所述假设通过实施方案1中说明的实验设计方法获得。取代的氨基酸残基优选是具有相互类似性质的氨基酸残基，诸如两个都是疏水性氨基酸残基。

包括本发明发明人之一的Udaka的小组已经报道了即使由所述肽序列中的一个或两个氨基酸残基的置换形成的肽序列也将类似地对于存在抗原的分子显示优异的结合性质。

1.″Decrypting the structure of MHC-I restricted CTL epitopes withcomplex peptide libraries.″Keiko Udaka，Karl-Heinz Wiesmuller，StefanKienle，Gunter Jung and Peter Walden.J.Exp.Med.181，2097-2108(1995).

2.″Tolerance to amino acid variations in peptides binding to the MHCclass I protein H-2Kb.″Keiko Udaka，Karl-Heinz Wiesmuller，Stefan Kienle，Gunter Jung and Peter Walden.J.Biol.Chem.270，24130-24134(1995).

3.″Self MHC-restricted peptides recognized by all alloreactive Tlymphocyte clone.″Keiko Udaka，Karl-Heinz Wiesmuller，Stefan Kienle，Gunter Jung and Peter Walden.J.Immunol.157，670-678(1996).

因此，可以预测，即使描述在本发明中的癌症抗原存活蛋白来源的肽或者即使上述由所述肽序列中的一个或两个氨基酸残基的置换形成的肽序列也将对于HLA-A分子类似地显示优异的结合性质。

本发明通过参考实施例说明如上。这些实施例仅作为实例说明，并且本领域技术人员将理解，多种修改实施例是可能的，并且这样的修改实施例包括在本发明的范围中。

<110>日本电气株式会社

     国立大学法人高知大学

<120>HLA结合肽

<130>64004107

<160>81

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>1

Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe

1               5

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe

1               5

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>3

Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe

1               5

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>4

Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe

1               5

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>5

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp

1               5

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>6

Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp

1               5

<210>7

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>7

Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu

1               5

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>8

Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu

1               5

<210>9

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>9

Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

1               5

<210>10

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>10

Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe

1               5

<210>11

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>11

Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu

1               5

<210>12

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>12

Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu

1               5

<210>13

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>13

Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe

1               5

<210>14

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>14

Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr Phe

1               5

<210>15

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>15

Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu

1               5

<210>16

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>16

Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg

1               5

<210>17

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>17

Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met

1               5 

<210>18

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>18

Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu

1               5

<210>19

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>19

Pro Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser

1               5

<210>20

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>20

Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe

1               5

<210>21

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>21

Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val

1               5

<210>22

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>22

Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His

1               5

<210>23

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>23

Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe

1               5

<210>24

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>24

Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe

1               5

<210>25

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>25

Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu

1               5

<210>26

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>26

Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp

1               5

<210>27

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>27

Phe Leu Glu Gly Cys Ala Cys Thr Pro

1               5

<210>28

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>28

Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu

1               5

<210>29

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>29

Glu Phe Glu Glu Thr Ala Lys Lys Val

1               5

<210>30

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>30

Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp

1               5

<210>31

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>31

Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly

1               5

<210>32

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>32

Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr

1               5

<210>33

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>33

Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly

1               5

<210>34

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>34

Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu

1               5

<210>35

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>35

Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu

1               5

<210>36

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>36

Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe

1               5

<210>37

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>37

Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu

1               5

<210>38

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>38

Ala Glu Ala Gly Phe Ile Hi s Cys Pro

1               5

<210>39

<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>39

Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met

1               5

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<211>9

<212>PRT

<213>智人

<400>40

Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe

1               5

<210>41

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>41

Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu

1               5                   10

<210>42

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>42

Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp

1               5                   10

<210>43

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>43

Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe

1               5                   10

<210>44

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>44

Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr Phe

1               5                   10

<210>45

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>45

Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe

1               5                   10

<210>46

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>46

Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe

1               5                   10

<210>47

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>47

Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe

1               5                   10

<210>48

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>48

Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe

1               5                   10

<210>49

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>49

Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

1               5                   10

<210>50

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>50

Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe

1               5                   10

<210>51

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>51

Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu

1               5                   10

<210>52

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>52

His Cys Pro Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu

1               5                   10

<210>53

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>53

His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe

1               5                   10

<210>54

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>54

Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys

1               5                   10

<210>55

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>55

Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu

1               5                   10

<210>56

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>56

Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp

1               5                   10

<210>57

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>57

Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu Gl u Gly Trp

1               5                    10

<210>58

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>58

Val Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu

1               5                   10

<210>59

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>59

Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu

1               5                   10

<210>60

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>60

Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala Cys Thr Pro

1               5                   10

<210>61

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>61

Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr Phe

1               5                   10

<210>62

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>62

Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu

1               5                   10

<210>63

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>63

Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Lys Lys Val

1               5                   10

<210>64

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>64

Val Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu

1               5                   10

<210>65

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>65

Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu

1               5                   10

<210>66

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>66

Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu

1               5                   10

<210>67

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>67

His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val

1               5                   10

<210>68

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>68

Asp Asp Asp Pro Ile Gly Pro Gly Thr Val

1               5                   10

<210>69

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>69

Ser Thr Leu Gly Gly Arg Gly Gly Arg Ile

1               5                   10

<210>70

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>70

Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg

1               5                   10

<210>71

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>71

Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys

1               5                   10

<210>72

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>72

Tyr Ala Cys ASn Thr Ser Thr Leu Gly Gly

1               5                   10

<210>73

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>73

Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

1               5                   10

<210>74

<211>10

 <212>PRT

<213>智人

<400>74

Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro

1               5                   10

<210>75

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>75

Phe Leu Glu Gly Cys Ala Cys Thr Pro Glu

1               5                   10

<210>76

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>76

Asp Asp Pro Ile Gly Pro Gly Thr Val Ala

1               5                   10

<210>77

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>77

Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg Ile

1               5                   10

<210>78

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>78

Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp

1               5                   10

<210>79

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>79

Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu

1               5                   10

<210>80

<211>10

<212>PRT

<213>智人

<400>80

Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr

1               5                   10

<210>81

<211>165

<212>PRT

<213>智人

<400>81

Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

1               5                   10                  15

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala

            20                  25                  30

Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr

        35                  40                  45

Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

    50                  55                  60

Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Gly Pro Gly Thr Val Ala

65                  70                  75                  80

Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu Gly Gly Arg Gly Gly Arg Ile Thr

                85                  90                  95

Arg Glu Glu His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val

            100                 105                 110

Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp

        115                 120                 125

Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys

    130                 135                 140

Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln

145                 150                 155                 160

Leu Ala Ala Met Asp

                165