杜氏盐藻异养表达载体的构建及异养转化株的鉴定

摘要

分别构建杜氏盐藻诱导型和组成型异养表达载体,筛选并初步鉴定异养转化藻株.通过RT-PCR从人胎盘组织中克隆并鉴定人红细胞葡萄糖转运基因(Glut1),构建以诱导型双拷贝碳酸酐酶启动子(DcA)驱动Glut1表达的中间载体,然后与筛选标记Bar盒连接形成盐藻诱导型异养表达载体pMDDGN-Bar.此外,将puQGus(简称GS)质粒的GUS基因去除,回收大片段载体后与Glut1基因连接,构建以组成型启动子ubiquitin驱动的组成型异养表达载体G5Glut1-Bar.通过电击转化法转化盐藻,使Glut1得到表达,筛选具有草丁膦(PPT)抗性的表达Glut1的盐藻转化株.提取转化株总RNA,RT-PCR检测目的基因的整合.克隆获得了1479 bp的Glut1序列,编码493个氨基酸.电泳检测各酶切结果表明Glut1、DCA、Nos和Bar盒已依次连接到相应的载体上,说明异养表达载体构建成功.经PPT筛选数周后,转化藻株生长良好,而对照野生藻株全部死亡.电泳检测RT-PCR产物表明两株转化株在相应位置(约250bp处)出现了较为特异的扩增条带,Blast同源性分析显示序列与人Glut1基因的同源性为100%.诱导型和组成型启动子驱动的盐藻异养表达载体构建成功,Glut1基因确已整合到盐藻的基因组中,构建的表达载体可用于盐藻中Glut1基因的表达.