杜氏盐藻异养转化藻株的鉴定及初步功能分析

摘要

杜氏盐藻(Dunaliella salina， D. salina)是一种单细胞的真核绿藻，无细胞壁，属于光合自养型生物。杜氏盐藻本身有很多优点：可在0.05～5M NaCl的极端环境中生存因而赋予其较强的抗污染能力；遗传操作简便；具有翻译后加工修饰；培养条件简单、成本低、生长周期短；自身营养价值很高；无毒无害等优点，使得盐藻成为一种表达外源基因的良好宿主。因此，开发盐藻作为生物反应器生产多种具有生物活性的外源蛋白如药用蛋白、血管抑素、抗体和疫苗等具有巨大的应用前景。
　　 盐藻的培养有两种方式：一种是开放池式的大规模培养，但是易受微生物污染、气候、光照、营养条件以及昼夜温差等因素的影响；另外一种是封闭式的光照生物反应器培养，但是利用光照生物反应器培养存在接种量大和光抑制效应等缺点。因此使得盐藻的生长速率和生物量难以大幅度提高，从而盐藻的利用受到了很大的限制。通过基因工程手段改变盐藻的营养模式(从光合自养型向异养型过渡)从某种程度上可以最大限度提高盐藻的生物量，为从根本上解决上述可能的难题提供理论依据。
　　 莱茵衣藻、小球藻、硅藻等藻类的异养研究发现，转入单个外源基因如小球藻的HUP1基因(H+/hexose cotransporter1)、人红细胞的Glut1基因(Glucosetransporter1)以及酿酒酵母的Hxt1、Hxt2和Hxt4基因等转变藻类的营养模式后，这些藻类可以利用外源的糖类进行异养生长，其生长速率和细胞密度均显著提高。葡萄糖转运蛋白(Glut1)是葡萄糖转运蛋白家族中的一种通道转运蛋白，位于细胞膜表面，是葡萄糖转运的主要载体。因此在本研究中我们尝试将Glut1基因转入盐藻细胞中以改变盐藻的营养模式，从而为提高盐藻的生长速度提供理论基础，为进一步建立杜氏盐藻生物反应器提供可行性思路。
　　 本课题组前期已经从人胎盘组织中克隆了人Glut1基因，并通过测序证实所克隆的Glut1基因序列的正确性，进一步利用基因重组技术构建了盐藻组成型和诱导型异养表达载体。本课题是在此基础上通过优化的电击转化方法将两种异养表达载体转入杜氏盐藻细胞中，利用草丁膦(Phosphinothricin, PPT)通过液体和固体筛选出杜氏盐藻异养转化藻株。结果表明，在PPT浓度为6μg/mL时对照野生藻全部死亡，而转化藻株生长良好，在此基础上共筛选出了3株组成型异养藻株和2株诱导型异养藻株，分别命名为：C1、C2、C3、I1和I2。进一步对筛选出的5株异养转化藻株进行RT-PCR鉴定，结果显示，5株转化藻株在相应大小的位置都出现了约为250bp的较为特异的DNA条带，提示外源基因Glut1已成功整合到杜氏盐藻异养转化藻株的基因组中。
　　 在转基因生物体中，转基因拷贝数对目标基因的表达水平和遗传稳定性有很大地影响，这使得转基因拷贝数的估算成为转基因生物研究中的重要内容和课题之一。实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR)和Southern botting技术是目前研究转基因拷贝数较为理想的方法，因此我们利用这两种技术分析5株异养转化藻株的拷贝数，结果发现3株盐藻组成型异养转化藻株C1、C2和C3的Glut1基因拷贝数分别为：2、1和3;2株杜氏盐藻诱导型异养转化藻株I1和I2的Glut1基因拷贝数分别为：4和4。Southern blotting检测C1、C2和C3的拷贝数与Real-time PCR结果一致，但在I1和I2中其拷贝数分别为3和2，稍低于Real-time PCR的结果。最后对异养转化藻株的葡萄糖转运进行了分析，结果表明在光照条件下各种不同的葡萄糖浓度对自养株、组成型异养株(C2)和诱导型异养株(12)的生长均有明显的影响，而且各株不同的杜氏盐藻在5mm的葡萄糖浓度作用下其生长明显强于其它葡萄糖浓度(P＜0.05)；同时发现在光照和葡萄糖(5mm)共同作用能明显提高各株不同杜氏盐藻藻株的生长速度(P＜0.05)，在黑暗条件和葡萄糖的共同作用下，组成型异养株的生长速率明显高于自养株和诱导型异养株(P＜0.05)，自养株和诱导型异养株的生长几乎停滞，其原因可能是诱导型异养株的Glut1基因由于拷贝数多随机插入到杜氏盐藻染色体DNA上的位点不确定干扰了杜氏盐藻细胞基因组的自稳系统而导致生长速度降低或停滞，或出现转基因沉默效应。而组成型的异养株在光照和葡萄糖的共同作用下其生长速率也明显高于黑暗和葡萄糖共同作用下的生长速率，提示该异养藻株可能处于兼性异养，如何使其处于完全异养状态，为进一步大规模的发酵培养奠定基础，尚需要进一步的研究。总之，本研究初步建立了异养转化藻株，为杜氏盐藻生物反应器的建立提供理论基础。

目录

文摘

英文文摘

1 引言

2 杜氏盐藻异养转化藻株的筛选及鉴定

2.1 材料

2.1.1 主要仪器设备

2.1.2 主要试剂

2.1.3 杜氏盐藻藻株、培养基和培养条件

2.1.4 载体

2.1.5 Glut1引物设计

2.2 方法

2.2.1 电击法转化盐藻细胞

2.2.2 盐藻异养转化藻株的液体和固体筛选

2.2.3 盐藻异养转化藻株和野生藻株总RNA的提取

2.2.4 杜氏盐藻异养转化藻株PCR鉴定

2.3 结果

2.3.1 盐藻异养转化藻株的筛选

2.3.2 异养转化藻株RNA质量鉴定

2.3.3 异养转化藻株的PCR鉴定

2.4 讨论

2.5 小结

3 杜氏盐藻异养转化藻株的初步功能分析

3.1 材料

3.1.1 主要仪器设备

3.1.2 主要试剂

3.1.3 盐藻藻株、培养基和培养条件

3.1.4 主要溶液配制

3.1.5 引物设计

3.2 方法

3.2.1 实时荧光定量PCR检测转化藻株Glut1拷贝数

3.2.2 Southern blotting检测转化藻株Glut1拷贝数

3.2.3 异养转化藻株葡萄糖转运分析

3.3 结果

3.3.1 实时荧光定量PCR检测转化藻株Glut1拷贝数

3.3.2 Southern blotting法分析转化藻株Glut1拷贝数

3.3.3 实时荧光定量PCR与Southern blotting分析转化藻株Glut1拷贝数的比较

3.3.4 异养转化藻株葡萄糖转运分析

3.4 讨论

3.5 小结

参考文献

综述：微藻生物反应器的研究进展及其应用前景

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果