狂犬病病毒N蛋白主要抗原区的表达及SPA-ELISA抗体检测方法的建立

摘要

为有效监测免疫狂犬病疫苗后的抗体水平,以狂犬病病毒N蛋白的主要抗原表位所在区域N1蛋白为包被抗原,建立了SPA-ELISA抗体检测方法.用RT-PCR方法分别扩增出狂犬病病毒Flury LEP株N基因及其N1区域(1 000～1 353 bp),将二者分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,并将重组的表达载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经1mmol/L IPTG诱导后进行免疫印迹分析.结果表明,重组的RVN和RV N1均以包涵体形式表达.与表达全长RV N相比,RV N1的表达量显著高于前者,且该重组蛋白同样具有良好的反应原性.用纯化的重组RV N1作为诊断抗原建立了检测犬RV抗体的间接ELISA方法.通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量是2mg/L,血清的最佳稀释度为1∶100,Protein A-HRP的稀释度为1∶4 000.用建立的ELISA方法对102份临床血清样品进行检测,与商品化试剂盒相比,二者的符合率为94.1%.试验结果表明基于主要抗原表位所在区域N1蛋白的SPA-ELISA方法可有效用于犬RV抗体水平的检测,为检测RV免疫抗体的ELISA试剂盒的研制奠定了基础.