一种高效无选择标记的黑曲霉基因组编辑方法

摘要

黑曲霉（Aspergillus niger）是一种重要的工业生产菌株，被广泛地应用于生产酶制剂和有机酸，但仍需要进行基因组改造提高它的应用潜力。CRISPR/Cas9技术是一种被广泛采用的黑曲霉基因组编辑技术，但由于需要在基因组中整合选择标记或基因编辑效率还有待提高，影响了其在工业菌株改造中的应用。本研究建立了一种基于CRISPR/Cas9技术的高效无选择标记的基因编辑方法。首先，利用5S rRNA启动子启动sgRNA的表达，构建了一个含有AMA1 （autonomously maintained in Aspergillus）复制起始片段的sgRNA和Cas9共表达质粒；同时通过敲除kusA基因构建非同源末端连接（non-homologous end joining pathway, NHEJ）修复缺陷的高效同源重组菌株；最后利用含有AMA1片段质粒的不稳定性，通过无抗平板传代丢失含有sgRNA和Cas9共表达质粒。利用该方法，在采用同源臂长度仅为20 bp的无选择标记供体DNA进行基因编辑时，基因编辑效率可达到100%。该方法为黑曲霉基因功能的研究和细胞工厂的构建奠定了基础。