一种无载体无选择标记基因转化小麦方法的建立

摘要

随着转基因技术的广泛应用，转基因作物的安全性越来越引起人们的重视。其中在基因转化中普遍使用的选择标记基因和载体骨架序列是影响转基因作物安全性评价的两个重要因素。目前，基因枪和农杆菌转化法均较难实现无载体无标记基因的转化，而花粉管通道法则有望解决这一问题，虽然该方法也存在着转化效率低、重复性差等缺点。 为了建立一种简便有效地进行无载体无标记基因转化小麦的方法，本文在对小麦花粉管通道法研究的基础上，提出了小麦的子房滴注转化法，并在转化中使用了不含选择标记基因和载体骨架序列的最小基因表达框(只含有ubiquitin启动子、smgfp基因、nos终止子和T-DNA边界序列)。 本文首先对影响小麦花粉管通道法转化的几个可能因素的进行了初步研究，包括对花粉管生长情况的观察和外源DNA的FITC(Fluorescein Isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)示踪观察。其中FITC示踪又包括观察转化时间和转化溶液对外源DNA进入小麦胚囊效率的影响，以及不同转化部位对外源DNA进入方式的影响等。结果表明，在授粉20min后，小麦花粉管可以进入子房；推测外源DNA沿花粉管延伸过程中形成的花粉管通道进入胚囊；转化部位对外源DNA进入子房的方式有影响，伤口加深，外源DNA进入的量相对较多；在授粉45和60min以后进行转化，外源DNA进入小麦胚囊的效率较高；相对于TE缓冲液，使用0.05％Silwet L-77+5％蔗糖作为转化溶液可以缩短外源DNA进入胚囊的时间。 在以上实验结果的基础上，本文提出了小麦的子房滴注转化法。实际转化操作表明，子房滴注转化法的PCR阳性率(4.5％)要高于花粉管通道法(2.0％)。此后，本文又从转化时间和转化溶液组成等方面对前者进行了优化。结果表明子房滴注转化法在使用0.05％Silwet L77+5％蔗糖的水溶液作为转化溶液，转化时间为60～90min时可以得到较高的转化率(8.3％)；Southern杂交检测表明，外源DNA已经整合到小麦基因组上；RT-PCR及Northern杂交检测表明，外源DNA在转基因植株中可以正常转录；荧光观察表明，smGFP可以在转基因植株中正常表达。 综上所述，本文成功建立了一种有效的将无载体无标记基因导入小麦的转化方法，即子房滴注转化法。

目录

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声明

引言

1文献综述

1.1转基因小麦研究进展

1.1.1基因枪法

1.1.2农杆菌介导法

1.1.3花粉管通道法

1.2选择标记基因对转基因作物安全性的影响

1.2.1选择标记基因在基因转化中的应用及潜在安全隐患

1.2.2选择标记基因安全隐患的解决方式

1.3载体骨架对基因转化的影响

1.3.1载体骨架对基因转化的作用

1.3.2载体骨架对基因转化的不利影响

1.3.3无载体基因的转化

1.4无载体无标记基因的转化

1.5 GFP基因概述

1.5.1 GFP的光谱特性

1.5.2 GFP基因的结构及生化特性

1.5.3 GFP在植物分子生物学研究中的应用

1.5.4 GFP的改进

1.6本研究的目的和意义

2小麦花粉管通道法转化的影响因素研究

2.1引言

2.2实验材料及设备

2.2.1植物材料

2.2.2质粒

2.2.3引物设计与合成

2.2.4试剂配制

2.2.5实验仪器

2.3实验方法

2.3.1苯胺兰染色观察花粉管

2.3.2质粒DNA的提取

2.3.3 FITC标记的外源DNA转化溶液的制备

2.3.4转化方法

2.4结果与讨论

2.4.1花粉管观察

2.4.2外源DNA进入小麦胚囊的途径

2.4.3转化时间对外源DNA进入胚囊效率的影响

2.4.4转化溶液对外源DNA进入胚囊效率的影响

2.4.5转化部位对外源DNA进入子房方式的影响

2.5小结

3小麦子房滴注转化法的建立

3.1引言

3.2实验材料及设备

3.2.1植物材料

3.2.2质粒

3.2.3引物设计与合成

3.2.4试剂配制

3.2.5实验仪器

3.3实验方法

3.3.1质粒DNA的提取

3.3.2转化元件的制备

3.3.3小麦转化

3.3.4小麦基因组DNA提取

3.3.5 PCR检测

3.3.6 Southern杂交检测

3.3.7小麦总RNA的提取

3.3.8 RT-PCR检测

3.3.9 Northern杂交检测

3.3.10转化材料的荧光检测

3.4结果与讨论

3.4.1转化方法对PCR阳性率的影响

3.4.2转化时间对PCR阳性率的影响

3.4.3转化溶液对PCR阳性率的影响

3.4.4转化材料的Southern杂交检测

3.4.5转化材料的RT-PCR和Northern杂交检测

3.4.6转化材料的荧光检测

3.5 小结

4结论与展望

4.1结论

4.2有待进一步开展的工作

4.2.1环境温度、湿度对转化时间的影响

4.2.2线性DNA片段的保护

4.2.3功能基因的转化

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致 谢