靶向Atp6i和T细胞免疫应答cDNA7的小干扰RNA载体构建及其腺相关病毒重组颗粒的制备

摘要

目的 构建靶向Atp6i和T细胞免疫应答cDNA7(TIRC7)的RNA干扰重组体,包装成腺相关病毒(AAV)重组颗粒,为使用该干扰重组体进行体内外基因治疗相关疾病提供依据.方法 设计特异性针对Atp6i和TIRC7基因共同区域的小干扰RNA序列,连接到经Xba Ⅰ和BglⅡ酶切线性化的pAAV.H1载体上并转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后进行测序分析.将酶切及测序分析鉴定成功的小干扰RNA序列与pAAV-RC、pHelper采用磷酸钙沉淀法共转染AAV-293细胞,复制、包装组成AAV.H1Atp6i重组病毒颗粒,以磷酸盐缓冲液(PBS)作为空白对照组,AAV.H1Luc作为阴性对照组,荧光显微镜观察转染效率.Western免疫印迹检测AAV.H 1Atp6i重组病毒颗粒对TIRC7蛋白表达的影响.结果 成功构建靶向Atp6i和TIRC7的RNA干扰重组体.重组质粒、pAAV-RC及pHelper成功转染AAV-293细胞,转染效率近100％,成功包装成AAV.H1Atp6i重组病毒颗粒.Western免疫印迹显示TIRC7蛋白在空白对照组、阴性对照组及AAV.H1Atp6i处理组均有表达,相对分子质量为75 000,AAV.H1Atp6i处理组TIRC7蛋白表达较空白对照组和阴性对照组均下降了80％ (0.271 ±0.072比0.988±0.042、0.992±0.053,均P＜0.05).结论 成功获得靶向Atp6i和TIRC7的RNA干扰重组体以及AAV.H1Atp6i重组病毒颗粒,可以干扰TIRC7蛋白的表达.