Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体构建和测序

摘要

前言: 自1998年Fire等首先报道后，RNAi技术迅速在功能基因组等领域发挥出了强大的作用，并且随着对哺乳动物细胞内一系列基因表达水平的成功下调以及细胞导入手段的改进。与基因替代、反义核酸等传统的基因治疗方法相比，RNAi技术有着明显优势。RNAi是指生物体内干扰性小RNA引起与其同源mRNA的特异性降解，因而抑制其相应基因表达的过程。RNAi在肿瘤研究方面也广泛应用，如肿瘤的发病机制、侵袭与转移、信号传导、细胞周期调控、凋亡和治疗等多方面。高丽芳等应用RNAi技术沉默STST3基因发现PC-3细胞增殖抑制率达64％，可诱导细胞凋亡。Collis等为抑制修复DNA损伤的酶(如人运动性共济失调-毛细管扩张ATM蛋白，转录调节蛋白抗体与DNA蛋白激酶催化亚单位)以增强放射和化疗对癌细胞的杀伤作用，通过使用质粒介导的shRNA在前列腺癌DU-145和PC-3细胞分别沉默这三种酶的表达，结果细胞内人运动性共济失调-毛细管扩张ATM蛋白、转录调节蛋白抗体与DNA蛋白激酶催化亚单位的蛋白质水平均显著下降，并且在抑制人运动性共济失调-毛细管扩张ATM蛋白与DNA蛋白激酶催化亚单位的表达后细胞对放射的敏感性明显增强。 survivin是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子之一。survivin抗细胞凋亡存在两种途径：一种是经典的Caspase途径，另一种是通过促进细胞分裂而抑制细胞凋亡。在后者survivin作为一种主要的染色体“过客”蛋白，参与细胞分裂多方面的调节。Kishi等检测了前列腺癌组织中的survivin mRNA水平，在前列腺癌组survivin表达显著高于正常前列腺组织组。PCa组survivin表达高者，其分期、Gleason分级、淋巴结转移、血管侵袭、切口阳性率等情况均明显较差，同时survivin表达量和PCa细胞的凋亡情况成反比。目前有研究应用针对survivin基因的RNAi技术，成功诱导了肿瘤细胞的凋亡，这在胃癌、宫颈癌、卵巢癌、大肠癌等肿瘤中已得到证实。 本实验采用RNAi技术，以survivin为靶基因，成功设计、构建两条能够在细胞内表达针对survivin基因的siRNA表达载体，为临床基因治疗前列腺癌奠定了良好的基础。 材料和方法: 一、材料 pBAsi-mU6-pur载体，E.coli DH5α菌株，限制性内切酶BamH1，HindⅢ及核酸分子质量标准DL-2000等试剂均购自TaKaRa公司。E．Z．N．A(R)质粒小量抽提试剂盒为美国Omega公司产品。 二、实验方法 1、首先在Genebank中检索survivin mRNA(NM_001168)。参考shRNA的设计原则，根据pBSsi-mU6-pur载体要求和Ambion公司提供的网上设计软件，最后选出两条片段作为survivin基因干扰片段。以间隔序列连接干扰片段正向和反向序列。两端加酶切位点，最后得到具有回文结构和发夹结构(hairpin siRNA)的干扰片段序列，用BLAST检索设计的DNA片段序列的特异性，与人类其他编码序列无同源性，将其送到TaKaRa公司合成。 2、pBAsi-mU6-puR表达载体的构建将退火双链用Takara公司的DNA Ligation Kit试剂盒与经BamHⅠ和Hind Ⅲ过双酶切的载体pBSsi-mU6-pur连接。 3、将反应液加入的E.coli DH5α Competent Cells中过夜培养，从转化平板上各挑取8个菌落，进行PCR扩增，各选取三个阳性克隆的PCR产物。 4、将所选产物送交大连宝生物工程有限公司进行测序，选取正确目的产物用E.Z.N.A(R)质粒小量抽提试剂盒进行质粒试抽提。提取质粒用引物pBAsi-R进行测序。 实验结果: 一、检测阳性克隆 1、序列1以及序列； 2、细菌培养PCR扩增后，根据电泳技术检测结果，各选取3个阳性克窿的PCR产物。 二、阳性克隆测序及质粒提取 将选取的阳性克隆PCR产物进行测序，结果正确。挑选其中两个过夜培养。第二天用质粒提取试剂盒提取质粒。 三、质粒测序 将所提取的两个质粒结果送交TaKaRa公司进行测序，测序结果均正确。 结论： 最终测序结果证实以成功构造Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体。应用该技术，可以将其用于肿瘤治疗的研究。根据RNAi技术的特点，特异性的引起肿瘤组织中Survivin．基因的沉默，从而达到对肿瘤基因治疗的目的。

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前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 RNA干扰及其技术的应用

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