利用同源重组构建BMP6基因真核表达载体及在成纤维细胞中表达量的研究

摘要

本研究旨在利用同源重组技术构建敖汉细毛羊BMP6基因表达载体及转染成纤维细胞后基因的表达量变化.实验以敖汉细毛羊为研究对象,采集40日龄的胎羊.首先,提取RNA并反转录成cDNA,参照GenBank中BMP6基因序列信息及pcDNA3.1载体序列设计1对含有同源臂的引物,通过PCR扩增获得BMP6基因片段、利用SoSo试剂盒将目的片段连接到pcDNA3.1真核表达载体上.鉴定pcDNA3.1-BMP6表达载体构建成功后,转化大肠杆菌(E.coli) DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的pcDNA3.1-BMP6表达载体转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测BMP6基因在成纤维细胞中表达量的变化.结果表明:经酶切、测序鉴定pcDNA3.1-BMP6表达载体构建成功,并且转染成纤维细胞后BMP6基因的mRNA、蛋白表达量均明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组(P＜0.01).在本实验条件下,利用同源重组技术成功构建了敖汉细毛羊BMP6基因表达载体,并且成功转染成纤维细胞,基因在细胞中过表达,为进一步研究其功能奠定基础.