OGT在甲烷减轻大鼠脊髓神经元氧糖缺失-复氧复糖损伤中的作用:与Nrf2表达的关系

摘要

目的 评价氧连氮-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)转移酶(OGT)在甲烷减轻大鼠脊髓神经元氧糖缺失-复氧复糖损伤中的作用及其与Nrf2表达的关系.方法 原代培养的大鼠脊髓神经元,以1×105个/ml密度接种于6孔板,采用随机数字表法分为4组(n=60):对照组(C组)、氧糖缺失-复氧复糖组(OGD/R组)、甲烷组(M组)和甲烷+OGT抑制剂四氧嘧啶组(MA组).采用无糖-无血清Earle平衡盐液,在37℃、5％CO2-95％N2缺氧培养箱中孵育2h,然后正常培养的方法制备脊髓神经元氧糖缺失-复氧复糖损伤模型.M组于复氧复糖时在培养液中加入200μl甲烷饱和生理盐水(甲烷终浓度1.8 mmol/L);MA组于M组复氧复糖后10 min在培养液中加入8 mmol/L四氧嘧啶.复氧复糖12 h时,测定神经元存活率、LDH漏出率和凋亡率;采用染色质免疫沉淀和实时荧光定量PCR(qPCR)法检测Nrf2基因启动子区OGT和H3K4me3表达水平;提取核蛋白,采用免疫沉淀和Western blot法测定H3K4甲基转移酶复合物调节亚基RBBP5的O-GlcNAc糖基化水平;采用邻位连接法检测H3K4甲基转移酶复合物催化亚基MLL1与组蛋白H3空间邻近水平;采用Western blot和qPCR法测定Nrf2及其mRNA的表达;采用ELISA法测定上清液SOD、过氧化氢酶(CAT)活性和MDA浓度.结果 与C组比较,OGD/R组和M组神经元存活率降低,LDH漏出率、凋亡率和上清液MDA浓度升高(P＜0.01);与OGD/R组比较,M组神经元存活率升高,LDH漏出率、凋亡率和上清液MDA浓度降低,Nrf2启动子区OGT和H3K4me3表达上调,RBBP5亚基O-GlcNAc糖基化、MLL1亚基与组蛋白H3空间邻近水平增高,Nrf2及其mRNA表达上调,上清液SOD和CAT活性升高(P＜0.01);与M组比较,MA组神经元存活率降低,LDH漏出率、凋亡率和上清液MDA浓度升高,Nrf2启动子区OGT和H3K4me3表达下调,RBBP5亚基O-GlcNAc糖基化、MLL1亚基与组蛋白H3空间邻近水平降低,Nrf2及其mRNA表达下调,SOD和CAT活性下降(P＜0.05或0.01).结论 OGT参与了甲烷减轻大鼠脊髓神经元氧糖缺失-复氧复糖损伤的过程,与上调Nrf2表达有关.