可溶性转化生长因子β1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体对人肝细胞凋亡的抑制作用

摘要

目的构建表达人转化生长因子-β1(TGF-β1)Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,并研究重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN是否拮抗外源性TGF-β1诱发的肝细胞凋亡,从而为该载体对于肝纤维化的临床应用提供理论依据.方法(1)以RT-PCR法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM-T-Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度.(2)以人正常肝细胞HL-7702为靶细胞,将细胞分为空白对照组、TGF-β1组、载体组、TGF-β1+载体组.用TUNEL原位标记法和流式细胞仪对各组细胞凋亡率进行检测.结果(1)经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确无误,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系.(2)TGF-β1组TUMEL阳性细胞明显多于其他各组,而TGF-β1+载体组和空白对照、载体组细胞相比,差异无统计学意义(P＞0.05).流式细胞仪分析结果显示,与其他各组细胞相比,TGF-β1组细胞碎片占细胞总数的百分比明显增加,而加入载体后细胞周期的比例、凋亡率和正常对照组相比没有明显变化.结论成功构建的重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN可有效的阻断外源性TGF-β1诱导肝细胞凋亡的作用,提示该载体可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.