嗜热酯酶APE1547催化活性的定向进化研究

摘要

对来源于嗜热古菌Aeropyrum pernix的酯酶（APE1547）催化活性进行定向进化研究。利用APE1547特殊的稳定性，建立了准确的高通量高温酯酶筛选方法。对第一代随机突变库筛选获得了催化活性较野生型提高1．5倍的突变体M010，序列分析表明其氨基酸突变为R526S。从第二代突变库中筛选出的总活力提高5舟倍突变体M020，突变位点为R526S／E88G／A200T／1519L，其比活力与M010一致。但表达量比野生型提高约4倍。对M020酶学性质表征发现，其最适pH为8．5，比野生型向碱性偏移0．5；活性中心残基酸性基团的解离常数（pK1）由野生型的7．0提高至7．5。晶体结构分析表明，突变位点R526距离活性中心较近，将其突变为Ser降低了活性中心的极性。抑制了催化残基His的解离，使酸性基团的解离常数升高。