粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）基因文库的构建及应用32P-DNA探针鉴定nif H基因亚克隆英文

摘要

采用入噬菌体置换型载体EMBL4,构建了水稻联合固氮菌Al-caligenes faecalis A15Hl菌株总DNA的基因文库。用Sau3AI限制酶完成部分酶切,取13～20kb大小的片段进行克隆。载体DNA经BamHI和SalI完全双酶切,左右臂“退火”形成左右臂载体分子后再与外源片段连接,左右臂载体分子与外源片段按照1:1的分子比进行体外连接。用E.coli BHB 2688和E.coli BHB 2690制备的包装抽提物进行体外包装,所得基因文库效价测定为1.2×106pfu,远远超过理论上所需的库容量。以32P标记的nifH基因作为探针,经3轮噬菌斑原位杂交,从基因文库中筛选出含有其同源顺序的克隆,并得到了梯度点杂交的验证。以32P-nifHDNA探针对所得重组噬菌体克隆之一（EMAFHl）进行Southern转移杂交,结果证实,其3.5kb的EcoRI酶切片段为nifH阳性杂交带。将其克隆到质粒pUC19DNA上后,转入受体菌JM101中,再经Southern转移杂交,证明所得重组质粒克隆（pAFHl）含有粪产碱菌中的与nif H基因有同源顺序的片段。