应用32P标记物检测glnA表达载体及转基因水稻愈伤组织中NPTⅡ酶活性（英文）

摘要

应用PCR技术扩增了编码巴西固氮螺菌Azospirillum brasilenseSP7谷酰胺合成酶（GS）的基因glnA,扩增的1.4kb DNA片段克隆于Bluescript-SK载体的EcoRV位点。序列测定结合限制性内切酶图谱分析,证实了携有BamHI位点的1.4kb DNA片段确为巴西固氮螺菌SP7的glnA基因。该基因与pCo24的Bg1 Ⅱ位点连接转化,筛选出以CaMV35S为启动子的glnA表达载体pGSC35。利用α-32P-dATP标记探针进行菌落原位杂交筛选阳性克隆,经三次连接转化后,又构建了另一个带水稻肌动蛋白1启动子的glnA表达载体pAGNB92。由水稻T986悬浮细胞系分离出原生质体。然后,以PEG法和电激法,用均含有NPTⅡ基因的glnA表达载体pGSC35和pAGNB92转化水稻原生质体。转化后的原生质体于含有G418抗生素的培养基上进行筛选。以γ-32P-ATP和卡那霉素为底物,经斑点杂交检测,37％的G418抗性愈伤组织显示出NPTⅡ酶活性。