人亲磷脂酸磷脂酶A1基因的克隆与序列分析及真核表达载体的构建

摘要

目的 克隆人亲磷脂酸磷脂酶A1(PA-PLA1)基因,分析该酶基因及其蛋白质的序列特征并构建PA-PLA1基因真核表达载体,为该酶生理功能的研究提供实验依据.方法 从人的肾脏组织中提取总RNA,逆转录制备cDNA.扩增人PA-PLA1基因并克隆测序.以Vector NTI 8.0、DNASTAR、ORF finder分析所克隆的人PA-PLA1基因及其蛋白质序列.构建真核表达载体pcDNA3.1-PA-PLA1,测序证实后转染小鼠分泌胰岛素细胞株MIN6,以Western blotting检测PA-PLA1蛋白的表达水平.结果 人PA-PLA1基因mRNA全长为2 923 bp,编码区长2 238 bp,编码1个由745个氨基酸残基组成的蛋白多肽.序列比对表明所克隆的人PA-PLA1基因与牛PA-PLA1基因同源,并与KIAA0725p和p125基因高度相似,三者在脂肪酶家族中形成亚家族,但KIAA0725p蛋白和p125蛋白具有常见的脂肪酶活性中心保守序列GX-S-XG,而PA-PLA1的该序列为SX-S-XG.真核表达载体pcDNA3.1-PA-PLA1构建正确并在所转染的MIN6细胞中过表达PA-PLA1蛋白.结论 PA-PLA1、KIAA0725p蛋白和p125蛋白在脂肪酶家族中形成亚家族,但PA-PLA1具有独特的脂肪酶活性中心保守序列SX-S-XG.所构建的PA-PLA1基因真核表达载体能在MIN6细胞中过表达小鼠PA-PLA1蛋白.该研究结果将为PA-PLA1生理功能的研究提供实验依据.