山羊GATA3基因克隆及其真核表达载体构建

摘要

本研究旨在克隆山羊GATA3(GATA binding protein 3)基因,构建其真核表达载体,并对该基因进行生物信息学分析.以山羊GA TA3基因编码区为种子序列(GenBank登录号:XM_018056969.1),通过SnapGene 4.1.9软件设计引物序列,应用RT-PCR方法扩增山羊GA TA3基因完整编码区序列,测序鉴定后基于其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1慢病毒重组质粒.利用脂质体转染方法将慢病毒重组质粒pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1与病毒包膜质粒pCMV-VSVG、包装质粒pNRF共转染HEK-293T细胞,进行慢病毒包装后收集病毒上清液,成功感染山羊耳尖成纤维细胞.结果显示,山羊GA TA3基因编码区序列全长1 335 bp,编码444个氨基酸,分子质量为47.94 ku,分子式为C2093 H3234 N626 O625 S24,等电点为9.47,其中丝氨酸含量最高(13.3％),色氨酸含量最低(1.1％).山羊GA TA3基因核苷酸序列与牛、猪、驴、马、小鼠及人的相似性分别为97.7％、94.2％、92.2％、92.4％、88.0％和90.1％,不同物种间相似性较高,进化过程中具有高度保守性.系统进化树分析表明,山羊与牛、猪、驴、马及人聚为一支,亲缘关系较近,与非洲蟾蜍、斑马鱼亲缘关系较远.跨膜结构域及亲/疏水性预测结果显示,山羊GATA3蛋白不存在跨膜结构域,为亲水性蛋白.信号肽预测结果表明,该蛋白定位于细胞质中.通过构建山羊GATA3基因慢病毒真核表达载体pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1,细胞水平上转染HEK-293T和山羊耳尖成纤维细胞,过表达GATA3基因,产生绿色荧光信号.本研究结果为山羊GATA3基因功能的研究提供了参考依据,为后续探究GATA3基因在山羊泌乳中的作用奠定了基础.