TaqMan实时荧光RT-PCR检测猪脑心肌炎病毒方法的建立与应用

摘要

针对猪脑心肌炎病毒(EMCV)基因组保守区域,设计并合成了特异性引物和TaqMan探针,建立了EMCV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法.通过常规RT-PCR方法扩增EMCV保守序列并将其连入pMD19-T载体,制备阳性标准质粒,优化反应条件,以10倍梯度稀释的标准品绘制标准曲线,EMCV标准曲线的相关系数为0.999.结果显示,该方法检测灵敏度达到10拷贝/μL,对猪捷申病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒检测结果均为阴性.方法重复性好,批内和批间变异系数均小于2％.检测采集自上海供港猪场、进境美国种猪、加拿大、法国种猪的血清样本145份,EMCV核酸的检出率国内猪场53.6％,美国猪检出率为27.6％,加拿大猪检出率为20％,法国猪检出率为26.7％.EMCV实时荧光RT-PCR方法的建立为该病的快速诊断和流行病学调查提供了有效手段.