黑曲霉β-甘露聚糖酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达

摘要

采用RT-PCR方法从黑曲霉中克隆得到β-甘露聚糖酶基因(manA)cDNA,按照毕赤酵母密码子优化序列后,构建至毕赤酵母表达载体pPIC9K的EcoR I和Not I酶切位点之间,并与醇氧化酶强启动子序列和α因子分泌肽信号序列融合.构建好的载体进行大肠杆菌转化,提取大量质粒并用Sac I线性化后进行毕赤酵母转化,筛选鉴定获得酵母转化子.重组菌接种到YPD培养基中摇瓶培养24 h后,经甲醇诱导,取发酵上清液经SDS-PAGE检测到预期分子量大小的目标蛋白带,β-甘露聚糖酶最高酶活为125.78 I U/m L,酶的比活力为188.86 I U/m g.结果表明β-甘露聚糖酶基因已在毕赤酵母中成功表达并能有效分泌到细胞外.