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一种融合表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母、制备方法及其应用

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本发明提出了一种融合表达β‑甘露聚糖酶和α‑半乳糖苷酶的毕赤酵母，其特征在于，包括pPIC9K载体、β‑甘露聚糖酶基因以及α‑半乳糖苷酶基因，所述β‑甘露聚糖酶基因与α‑半乳糖苷酶基因组成融合基因，融合基因两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列。本发明通过β‑甘露聚糖酶和α‑半乳糖苷酶融合使用可以更加彻底地降解半乳甘露聚糖，以β‑甘露聚糖酶和α‑半乳糖苷酶融合使用作为饲料添加剂处理饲料后不会造成营养物质浪费。

著录项

公开/公告号CN113151025A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-07-23

原文格式PDF
申请/专利权人上海国龙生物科技有限公司;
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申请/专利号CN202110270368.X
发明设计人朱佑民;钟诚;于婷婷;张慧;郑业鸿;雷雨;孟维龙;张文荟;林莉莉;
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申请日2021-03-12
分类号C12N1/19(20060101);C12N15/62(20060101);C12N15/81(20060101);C12N9/42(20060101);C12N9/40(20060101);A23K10/14(20160101);A23K20/189(20160101);C12R1/84(20060101);
代理机构32320 南京禾易知识产权代理有限公司;
代理人张松云
地址 201612 上海市松江区书海路1505号
入库时间 2023-06-19 11:59:12

说明书

技术领域

一种融合表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母、制备方法及其应用。

背景技术

半乳甘露聚糖是一种抗营养因子，可以增加饲料的粘度，降低饲料中营养物质的利用率。动物体内不能产生降解半乳甘露聚糖的酶类，动物采食半乳甘露聚糖含量高的食物后，无法对饲料养分充分消化和吸收。动物会产生食欲不振和体重减轻等症状。

现有技术通过单一的酶如β-甘露聚糖酶消除抗营养因子半乳甘露聚糖，但是，β-甘露聚糖酶只能水解甘露糖骨干的1,4连接键，不能水解1,6键连接的半乳糖残基，不能把半乳甘露聚糖充分降解。而且单一的酶降解半乳甘露聚糖后的产物分子量大，不容易被动物吸收利用，造成了营养物质的浪费，也使得动物觅食后长不快。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，本发明提出了一种融合表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母、制备方法及其应用，以β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶融合使用作为饲料添加剂处理饲料后不会造成营养物质浪费。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种融合表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母，包括pPIC9K载体、β-甘露聚糖酶基因以及α-半乳糖苷酶基因，所述β-甘露聚糖酶基因与α-半乳糖苷酶基因组成融合基因，融合基因两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列。

进一步地，所述毕赤酵母的表达质粒包括pPIC9K载体和EcoRI酶切位点以及Not1酶切位点之间的全长融合基因。

进一步地，一种如权利要求1-3任一所述的融合表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的制备方法，包括如下步骤：

S1、化学合成改良的β-甘露聚糖酶与α-半乳糖苷酶的融合基因；

S2、酶切S1中所得融合基因与酶切线性化的毕赤酵母表达载体连接或重组，得融合基因表达质粒；

S3、将S2中构建好的融合基因表达质粒酶切线性化后，转化入毕赤酵母感受态细胞中；

S4、通过His缺陷和G418抗性筛选出有融合基因插入的毕赤酵母菌。

进一步地，所述S2中融合基因序列与酶切线性化的毕赤酵母表达载体通过T4连接酶或2X ClonExpress Mix连接或重组。

进一步地，所述S3中表达质粒采用Sacl酶切线性化。

进一步地，所述表达质粒线性化后跑1%的agarose琼脂糖凝胶确认重组质粒完全线性化。

进一步地，将完全线性化的所述表达质粒转化入毕赤酵母感受态细胞中，220 rpm条件下进行摇床培养1.5h。

进一步地，将所述整合有β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的融合基因的毕赤酵母菌株跑SDS-PAGE胶鉴定分泌蛋白，挑选得β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的融合基因表达量高的菌株。

进一步地，一种融合表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母的应用，包括如下步骤：

a、将毕赤酵母工程菌株转接入含有10-15mL BMGY培养基带透气塞的50mL离心管，在28℃，220 rpm条件下进行摇床培养至OD600=2-5；

b、菌体重悬于BMM培养基，220 rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5%甲醇诱导，培养4-5天；

c、应用：将β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的融合酶作为饲料添加剂应用于降解饲料中的抗营养因子半乳甘露聚糖。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：通过β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶融合使用可以更加彻底地降解半乳甘露聚糖，以β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶融合使用作为饲料添加剂处理饲料后不会造成营养物质浪费。

附图说明

参照附图来说明本发明的公开内容。应当了解，附图仅仅用于说明目的，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。在附图中，相同的附图标记用于指代相同的部件。其中：

图1为实施例2与实施例1相比的酶表达图。

附图标记说明：A： Protein ladder，B：使用本发明的方法融合表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶（分子量125 KDa），C：单独表达β-甘露聚糖酶（分子量40 KDa），D：单独表达α-半乳糖苷酶（分子量84 KDa）

图2为实施例2与实施例1相比的酶切对照图。

附图标记说明：A：单独使用β-甘露聚糖酶，可以部分降解半乳甘露聚糖并释放部分单糖和低聚糖；B：单独使用α-半乳糖苷酶，可以降解半乳甘露聚糖的侧链半乳糖；C：使用本发明的方法融合表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶后，可以彻底降解半乳甘露聚糖并释放大量单糖和寡糖；D：半乳甘露聚糖（不加酶）；E： 1%甘露糖；F： 1%半乳糖；G： 1%蔗糖；H：1%麦芽糖；I： 1%乳糖；J：1%棉籽糖；K：1%低聚半乳糖。

具体实施方式

容易理解，根据本发明的技术方案，在不变更本发明实质精神下，本领域的一般技术人员可以提出可相互替换的多种结构方式以及实现方式。因此，以下具体实施方式以及附图仅是对本发明的技术方案的示例性说明，而不应当视为本发明的全部或者视为对本发明技术方案的限定或限制。

实施例1

融合表达β-甘露聚糖酶基因和α-半乳糖苷酶基因manβ-agaα并消除饲料中半乳甘露聚糖的方法及其应用，包括如下步骤：

优化改良的β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的融合基因manβ-agaα的序列，如SEQID No.1；序列两端包含EcoRI和Not1酶切位点序列和载体pPIC9K的同源臂序列；

化学合成如SEQ ID No.1所示的序列；

融合基因manβ-agaα片段和载体pPIC9K均经EcoRI和Not1双酶切，酶切体系如下：

片段/载体 44μL

EcoRI 5μL

Not1 5μL

10X buffer 6μL

60μL

将酶切后的融合基因manβ-agaα片段与酶切后的pPIC9K载体连接，连接体系如下：

线性化载体 15μL

片段 5μL

T4连接酶 4μL

ddH

将连接产物转化入大肠杆菌Top10感受态细胞；

涂布含氨苄青霉素的平板；

PCR检测阳性克隆。菌检上游引物PF1: AACAGACCATGCCGTTGCTA，下游引物PR1:AACGGCTGGGATTCGGAAAT；

扩大培养并用质粒小提试剂盒抽提质粒，得到目的质粒pPIC9K-manβ-agaα；

质粒均用SacI酶切线性化，酶切体系如下：

质粒 48μL

SacI 6μL

10X buffer 6μL

60μL

跑1%的agarose琼脂糖凝胶确认质粒完全线性化；

将线性化的质粒电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞中，220 rpm条件下进行摇床培养1.5-2h，4500rpm离心7min收集菌体；

将菌体涂布在His缺陷平板上培养2-3天，挑选单菌落；

通过2-4mg/mL G418的平板筛选出含有融合基因的毕赤酵母菌p-manβ-agaα；

将毕赤酵母工程菌p-manβ-agaα转接入含有10-20mL BMGY培养基带透气塞的50mL离心管，在28℃，220 rpm条件下进行摇床培养至OD600=3-5；

4500 rpm离心7min收集菌体；

菌体重悬于BMM培养基，220 rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5%甲醇诱导，培养4-5天；

4500 rpm离心5min收集发酵液，得到粗酶液；

跑SDS–PAGE胶鉴定分泌蛋白，评估各菌株目标蛋白的表达水平，挑选表达量高的菌株如图1所示；

酶活性测定，挑选产酶活高的菌株；

粗酶提纯。

实施例2

融合表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶manβ-agaα并用于消除饲料中半乳甘露聚糖的方法及其应用，包括如下步骤：

优化改良的β-甘露聚糖酶基因manβ，如SEQ ID No.2，前端有与载体pPIC9K的同源臂序列，后端有与α-半乳糖苷酶基因agaα的同源臂序列；优化改良的α-半乳糖苷酶基因agaα，如SEQ ID No.3，后端有与载体pPIC9K的同源臂序列；

化学合成如SEQ ID No.2和如SEQ ID No.3所示的序列；

载体pPIC9K经EcoRI和Not1双酶切，酶切体系如下：

片段/载体 42μL

EcoRI 6μL

Not1 6μL

10X buffer 6μL

60μL

将带有同源臂的β-甘露聚糖酶基因manβ片段、α-半乳糖苷酶基因agaα片段和酶切后的pPIC9K载体重组，重组体系如下：

线性化载体 10μL

manβ片段 10μL

agaα片段 10μL

2X ClonExpress Mix 40μL

ddH

将重组产物转化入大肠杆菌Top10感受态细胞；

涂布含氨苄青霉素的平板；

PCR检测阳性克隆，菌检上游引物PF1: AACAGACCATGCCGTTGCTA，下游引物PR1:AACGGCTGGGATTCGGAAAT；

扩大培养并用质粒小提试剂盒抽提质粒，得到目的质粒pPIC9K-manβ-agaα；

质粒用SacI酶切线性化，酶切体系如下：

质粒 40μL

SacI 5μL

10X buffer 5μL

50μL

跑1%的agarose琼脂糖凝胶确认重组质粒完全线性化；

将线性化的质粒电转化入毕赤酵母感受态细胞中，220 rpm条件下进行摇床培养1.5h，4500rpm离心7min收集菌体；

将菌体涂布在His缺陷平板上培养2-3天，挑选单菌落；

通过2-4mg/mL G418的平板筛选出含有融合基因的毕赤酵母菌；

将毕赤酵母工程菌株p-manβ-agaα转接入含有10-15mL BMGY培养基带透气塞的50mL离心管，在28℃，220 rpm条件下进行摇床培养至OD600=2-5；

4500 rpm离心7min收集菌体；

菌体重悬于BMM培养基，220 rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5%甲醇诱导，培养4-5天；

4500 rpm离心5min收集发酵液，得到粗酶液；

跑SDS–PAGE胶鉴定分泌蛋白，挑选表达量高的菌株如图1所示；

酶活性测定，挑选产酶活高的菌株；

粗酶提纯；

以半乳甘露聚糖为底物，使用实施例1中制备所得融合酶MANB-AGAA协同降解半乳甘露聚糖，并以实施例2中制备所得酶MANB和AGAA单独降解半乳甘露聚糖作为对照，反应体系如下：

1ml底物（1％半乳甘露聚糖）+40U酶（融合酶MANβ-AGAα）

反应时间：4h

跑PLC检测酶切结果如图2所示。

以上实验结果表明，本方法融合表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶可以更加彻底地降解半乳甘露聚糖。因此，本发明可用于饲料添加剂降解抗营养因子半乳甘露聚糖。

本发明的技术范围不仅仅局限于上述说明中的内容，本领域技术人员可以在不脱离本发明技术思想的前提下，对上述实施例进行多种变形和修改，而这些变形和修改均应当属于本发明的保护范围内。

序列表

<110> 上海国龙生物科技有限公司

<120> 一种融合表达β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的毕赤酵母、制备方法及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3483

<212> DNA

<213> 融合基因manβ-agaα(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

gagaggctga agcttacgta gaattcatgg gtcgagagtc tctattagct gcaatatgct 60

tcgctggatt gcctgcatgg gtcgcagtaa ggccaatgtg gggccagtgt ggaggcatga 120

cgtacactga tgacacggtc tgcgcaacag gcactactga gaacgcctat tggataggtt 180

ttgactatgg agttgccgat caggttgata aggattatat tgtgaacgct ggttccactc 240

aagtaagaac ccttggtttc aacgacggaa ctccagctgg tgatgatatt gctgtccccg 300

tttactacca gtcttggtct aatggtacaa taaccatcaa cttgggtcca tctaacggat 360

tacaagtgtt tgccggatcc tacgatgccc tgatcggacg attacgtact aataattctg 420

actactccgg aggaatggac gtttatgtcc agcaaattct gggctctacc taccatgcct 480

tttacactgc tcctcaagtt attgcagcat tcaagaagta cgaaaacgga tttgtttcaa 540

gatatattgt tgagcccgcc atccttgcct gggaattggc taatgagact agatgcgctg 600

gttctacagg tacagttact cctggtaact gtactaacgg aactattacc tggcaatgga 660

ttgctggaag tgcctatatt aagtccattg accccaacca cgcagttgat ggagttggtg 720

atggaggatt cattaatgac ccaggtaacg ctccttcata tccacgaggt acactgggaa 780

tagattttta cgaagctgac ttacaaatac ctacaattga tttccttggc acattccata 840

tgtatccctc ttcctgggga caaaacgacc caaactatgc tgtcggcgct ggtaaccagt 900

ggataacaga ccatgccgtt gctatgggca gagccgcagg taaacccgtg attatggaag 960

agcgaggagt cacgattgct agagatcagg ctactggcgc cgaatggtac gatacggtta 1020

taagtactgg tggccttgcc cgtgacttgt gggctggatc ccatctaagt ggtgacaaac 1080

caaatgccga tggctacaga gaatacccag acggtgatgt gttttaccca caaatgcacg 1140

ctgctttgaa gatgcgaggt atgcttagat cagcagcttt gagagctact gctataggtt 1200

tgctaaccgc ttcacaggat ggtcccgttg ctctggcaca aagtacctct ggcagtgatg 1260

ctatcgtgga ggttggtact gcattcgcct tgcacggagc tggaatgtct tacgttcact 1320

ctgcagacac tacaactggt gatctgataa ctgaccacga cggtgcatcc gtgagtggtg 1380

ccttaccatc tcctggagaa tctggattcg tgagtggcgt tggtacaatt ggaagagttc 1440

gacgaatgga gtttccagtt gatggcagag gaggagattt ccgaatccca gccgttagga 1500

ttagacaaac tgacggttat acagtttctg atctgcgtta ccaagtttct catgaggtcg 1560

atggaaaacc ttcattgccc ggtattttgc cagcatttgg tgaagctgga gacgttacta 1620

cattgtacgt ggtgcactta tatgacaact attcagcaag tgtggcagct gactcataca 1680

gtgtatttcc agagttcgat gccatggtga gatcagttaa tatcactaac aaggttggtt 1740

caggagatat aactctggtg gagcagctgg catcccttgt ggattttccc cttgaacaag 1800

atttggatct gctttcactg agggaaggtt gggcacgaga agctcacaga gaaagattcc 1860

gacgtgtata tggcgtttcc caaggattcg gttcttcaac cggatatagt agtctgacac 1920

acaacccatt ctttgccttg gcccatgcac cctctactac tgagtctggt gaagcctggg 1980

gtgccttcaa tctaatctac actggttcat ctttctcaca ggtagagaaa agttcacaaa 2040

atggactgag agcattgatc ggttttaatc cagatttgca ctcttggaca ttgggtccag 2100

gaggagaaac ttcccccgag tgcgttgatt ctgtgtattc caatgaggga ataggtgtta 2160

tgagtagaaa gcttcatagg tatacgagaa aacatttaat tagaagtaag tttgctacgg 2220

attccgatcg tcctccattg aacagttggg agggccgtgt gtataattac aatcaaacta 2280

gtattgaaag gctggccaga ttccagtcag cccttggaat tagactgttt gttcatatga 2340

acgatgatgg taagatgtgg ttcggtgatt atccagaaag gactagtgat aacgcaggct 2400

cactaggttg gaccccaaat ccagatcgtt tcgaccctgg tttgggtcca gtggtggaga 2460

ggattgtaac taacatggac attaacggaa ccgcaggaga aaagttgcgt tttggttgga 2520

gggtagaacc tgagatggtg ccaaattctt ccggtttgta taggaaacac ccagattggg 2580

tggttcatgc tggtagttat ccacgaactg aaagatctag aaaccaattg gtcttgaact 2640

tggcattgct tccagaagtt caagacattg actttactaa cttgccttta aattcagccg 2700

acatttccta tgtgaagtgg gataacaaca gaggtatggt tcccaacagt ccacgtactt 2760

accatgaata tatgctggga ttacacgtca tgttagatac actatcctca agatttccaa 2820

acttgttcat cgagggatgt gctagtggtg gtgatggacg ttttgacgct ggtattttac 2880

actactttcc tgcccaattc tggtctgata acaatacaga cggagtggac agaatcatac 2940

agttcggaac ctccctggct tataggcccc catctgcaat gggagcccat ctggtttccg 3000

caccaaacca tcaaaccggt cgtaccgttc cattgggtga atttagagca catgttgctg 3060

gtggctcctt tggattgttt gaactggatc ctgctacttt acaagataat ccaagggaag 3120

tcagagaatt gatcaagctg attgagaagg tcaatccaat cgttaccggt gattccttgt 3180

atcgtctgag attgcctgag gacgagtcac aatggccagc tttgtttgtc gttgaagatg 3240

gatcacaagc agttcttttt ggctatttcc aggtcggacc aaataatcat agagctgtac 3300

cttggagatt gcaggtagga ttggacccag aagctagata ctctgttgac ataggtaacg 3360

ccactatgta taccgccacc ttgatgggta acatgggtct atttactttt aatgacagtg 3420

agtatggttc tgttaaggtt gttttcgaac gacaagcggc cgcgaattaa ttcgccttag 3480

aca 3483

<210> 2

<211> 1181

<212> DNA

<213> 改良的β-甘露聚糖酶基因manβ(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 2