BLM解旋酶基因的克隆、表达载体构建及表达研究

摘要

克隆获得BLM基因全长CDS区,研究其在细胞中的表达情况.从人前列腺癌PC3细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,采用分段克隆的方法获得BLM全长CDS区,将其定向插入到原核表达载体pET-32a和真核表达载体pEGFP-N3,构建pET-32a-BLM和pEGFP-N3-BLM.将获得的重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞或转染PC3细胞,通过SDS-PAGE、Westernblotting、荧光定位观察等方法研究人BLM解旋酶在细胞中的表达或定位.BLM解旋酶的原核表达结果显示,不同IPTG浓度对BLM解旋酶的表达量影响不大,低温有助于其表达量的提高.Western blotting检测发现,构建的人BLM解旋酶重组原核和真核表达载体分另能在大肠杆菌细胞和PC3细胞中表达出分子量约为179 kD的蛋白质,与预期分子量大小一致.荧光共定位结果显示,人BLM解旋酶主要定位在细胞核.成功克隆了人BLM解旋酶全长CDS区,且构建的重组表达载体pET-32a-BLM和pEGFP-N3-BLM能在相应的宿主细胞中正确表达.