米黑根毛霉脂肪酶基因的克隆、表达及活性分析

摘要

以米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)为出发菌株,采用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取其总RNA,反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出米黑根毛霉脂肪酶(RML)结构基因.构建真核重组表达质粒RML-pPIC9K,电转化His+缺陷型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,利用MD-MM平板及PCR方法筛选和鉴定出重组子,进行甲醇诱导表达.结果表明,RML基因能够在巴斯德毕赤酵母中实现高效表达.重组子发酵液经SDS-PAGE分析显示获得了与预期大小(约39 kD)一致的蛋白表达特异条带,用NaOH滴定法测其活性,酶活可达84 U/mL.