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第一章 绪论
1.1 脂肪酶简介
1.1.1 脂肪酶的定义
1.1.2 脂肪酶的来源
1.1.3 脂肪酶的结构与催化机理
1.1.4 脂肪酶的底物特异性
1.2 脂肪酶的应用
1.2.1 生产单甘酯
1.2.2 食品工业
1.2.3 医药
1.2.4 皮革生产
1.2.5 纸浆和造纸
1.2.6 手性化合物的制备
1.2.7 洗涤剂
1.3 脂肪酶基因的表达
1.3.1 脂肪酶基因在原核细胞中的表达
1.3.2 脂肪酶基因在真核细胞中的表达
1.4 米黑根毛霉脂肪酶简介
1.5 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展
1.5.1 常用表达菌株及表达载体
1.5.2 基因整合及表达调控的机理
1.5.3 外源基因自身特性对P.pastoris表达系统的影响
1.5.4 P.pastoris表达产物的糖基化
1.5.5 外源蛋白的翻译后修饰
1.6 本课题的研究意义与内容
1.7 本课题的来源
1.8 本课题的主要技术路线
第二章 米黑根毛霉脂肪酶基因的克隆和表达载体的构建
2.1 引言
2.2 实验材料与仪器
2.2.1 菌种和质粒
2.2.2 主要生化试剂
2.2.3 主要实验仪器
2.2.4 溶液和培养基
2.3 技术路线
2.4 实验方法
2.4.1 目的基因的获得
2.4.2 表达载体pPIC9K-RML的构建
2.4.3 重组质粒的获得
2.4.4 重组质粒的鉴定
2.4.5 重组质粒中目的基因序列的测定
2.5 实验结果与分析
2.5.1 Rhizomucor miehei Lipase基因的扩增结果
2.5.2 重组质粒的构建和双酶切鉴定
2.5.3 重组质粒的基因序列测定结果
2.6 小结与讨论
第三章 米黑根毛霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达
3.1 引言
3.2 实验材料与仪器
3.2.1 菌种和质粒
3.2.2 主要生化试剂
3.2.3 主要实验仪器
3.2.4 溶液和培养基
3.3 实验方法
3.3.1 毕赤酵母重组表达载体的构建
3.3.2 重组质粒的线性化
3.3.3 毕赤酵母感受态细胞的制备及转化
3.3.4 重组子的筛选
3.3.5 甲醇诱导脂肪酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达
3.3.6 表达产物的SDS-PAGE电泳检测
3.3.7 表达产物酶活的测定
3.4 实验结果与分析
3.4.1 酵母重组子的筛选
3.4.2 表达产物的SDS-PACE电泳检测
3.4.3 重组毕赤酵母的产酶分析
3.5 小结与讨论
3.5.1 小结
3.5.2 讨论
第四章 毕赤酵母重组菌发酵条件的优化
4.1 引言
4.2 实验材料与仪器
4.2.1 实验菌株
4.2.2 主要生化试剂
4.2.3 主要实验仪器
4.2.4 培养基
4.3 实验方法
4.3.1 重组菌生长曲线和pH值曲线的测定
4.3.2 重组菌发酵条件的优化
4.3.2 酶活测定
4.4 实验结果与分析
4.4.1 重组菌生长曲线和pH值曲线
4.4.2 重组菌发酵条件的优化
4.5 小结与讨论
4.5.1 小结
4.5.2 讨论
第五章 米黑根毛霉脂肪酶酶学性质的初步研究
5.1 引言
5.2 实验材料与仪器
5.2.1 实验菌株
5.2.2 主要生化试剂
5.2.3 主要实验仪器
5.2.4 主要溶液
5.3 实验方法
5.3.1 脂肪酶的酶活测定方法——对硝基苯酚比色法(p-P法)
5.3.2 酶学性质研究
5.4 实验结果与分析
5.4.1 对硝基苯酚标准曲线的绘制
5.4.2 RML粗酶的酶学性质
5.5 小结与讨论
5.5.1 小结
5.5.2 讨论
结论与展望
结论
展望
参考文献
附录 重组质粒pPIC9K-ML的RML测序结果
攻读硕士学位期间取得的研究成果
致谢
