米黑根毛霉脂肪酶密码子优化及其在毕赤酵母中的高效表达

摘要

脂肪酶作为生物催化剂广泛应用于食品、医药和生物柴油等领域。米黑根毛霉脂肪酶(RML)是一条α/β型单链多肽，具有较好的立体选择性、较高的水解和转酯活力。由于天然米黑根毛霉脂肪酶产量低，无法满足大规模工业生产的需求。本研究利用基因工程技术将米黑根毛霉脂肪酶基因整合到毕赤酵母实现异源高效表达，提高了米黑根毛霉脂肪酶产量，对该酶的工业化应用具有重要意义。本文以实验室保存的RML全长基因为出发材料，根据毕赤酵母的密码子偏好性，优化了RML基因密码子，并以此构建了以FLD1为启动子的诱导表达毕赤酵母基因工程菌。运用摇瓶发酵筛选，并初步研究了异源表达的米黑根毛霉脂肪酶的酶学性质。主要的研究内容及结果摘要如下。
　　1.优化了RML基因。以实验室保存的米黑根毛霉脂肪酶基因为出发材料，根据毕赤酵母的密码子偏好性，利用重叠延伸PCR定点突变优化了RML基因中7个低频密码子，并以优化前后含前肽的RML基因分别构建毕赤酵母诱导型分泌表达载体pFLD-RMLori和pFLD-RMLopt。
　　2.构建了RML高效基因工程菌。将pFLD-RMLori和pFLD-RMLopt载体分别电转化入GS115中，通过三丁酸甘油酯酶活力检测平板初筛和摇瓶发酵复筛，分别获得酶活力最高的两株菌GS115/pFLD-RMLori32＃和GS115/pFLD-RMLopt42＃，其酶活力分别达到120U/ml和195U/mL。经密码子优化后，RML酶活力提高了60％。
　　3.初步研究了异源表达的RML酶学性质。以GS115/pFLD-RMLopt42＃克隆子摇瓶发酵上清液为对象，利用对硝基苯酚酯(pNP)对重组RML进行了初步的酶学性质研究。结果表明，RML的最适反应温度和pH分别为45℃和pH8.0。40-60℃温育2h后，酶活力只残留约15％，K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、Cu2+等对RML酶活有轻微抑制作用，Fe3+、Zn2+、Fe2+则对其有较强抑制作用，而Sr2+对RML有一定激活作用；其最适水解底物为对硝基苯酚丁酸酯(C4)。

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目录

1 Introduction

1.1 Lipases

1.2 Sources of lipase

1.3 Structure of lipase

1.4 Yeast as a protein expression system

2 Materials and methods

2.1 Microbial Strains used in this study

2.2 Medium and buffer solution

2.3 Protocols used in the experiment

3 Experimental Procedures

3.1 Codon optimization

3.2 Expression of RMLori and RMLopt in P. pastoris

4 Results and discussion

4.1 Codon optimization

4.2 Expression

4.3 Enzymatic properties of recombinant RML

5. Conclusions and Future Study

5.1 Conclusions

5.2 Future study

致谢

参考文献

Appendix 1 Gene sequences

Appendix 2 Instruments and equipments