卵圆细胞恶性转化相关差异性甲基化基因的筛选及验证

摘要

目的 通过对卵圆细胞恶性转化相关差异性甲基化基因的筛选及验证,初步探索卵圆细胞发生恶性转化的表观遗传学调控机制.方法 利用简化甲基化测序(Reduced representation bisulfite sequencing,RRBS)对转染肝细胞癌基因HBV X(HBX)发生恶性转化的卵圆细胞(HBX-LE6)与正常大鼠肝卵圆细胞(LE6)进行甲基化测序,获得差异性甲基化区域(Differen-tially methylated region,DMR)与相关差异性甲基化基因(Differentially methylated gene,DMG),通过实时定量聚合酶链反应(Real-time qPCR)、蛋白质印迹法(Western Blot)、甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)进行检测,验证甲基化对DMG表达的调控作用.结果 共筛选相关DMR 1434个,其中高甲基化DMR 623个(位于启动子128个);低甲基化DMR 811个(位于启动子216个),DMG共1987个.挑选启动子均存在高甲基化DMR的相关基因如泛素特异性蛋白酶18基因(USP18)、有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶6(MAP3K6)、SWI/SNF染色质重塑复合物(SMARCB1)、表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤抑制因子(CYLD)、环指蛋白39(RNF39)、含16的锌指和BTB结构域蛋白(ZBTB16)、同源异型盒基因D8(HOXD8)进行验证.USP18、SMRCB1、CYLD、ZBTB16在LE6和HBX-LE6中的mRNA相对表达量分别为[(4.50±0.43),(2.09±0.18)]、[(7.34±0.11),(2.57±0.29)]、[(7.30±0.27),(3.44±0.13)]、[(7.01±0.06),(1.29±0.32)],与LE6相比,其在HBX-LE6中表达显著下调(P<0.05).与LE6相比,SMARCB1在HBX-LE6中的蛋白表达明显下降[(6.26±0.25)比(1.53±0.34),P<0.05].USP18、ZBTB1、CYLD的蛋白表达在三组间差异无统计学意义(P>0.05).5-Aza-CdR对HBX-LE6细胞干预后,MSP证实SMARCB1在HBX-LE6中的高甲基化被5-Aza-CdR抑制,其mRNA与蛋白表达水平均显著上调(P<0.05).结论 DNA甲基化参与卵圆细胞恶性转化的表观遗传学调控机制,DNA高甲基化下调卵圆细胞中抑癌基因SMARCB1可能参与了癌变的过程,但机制仍需要进一步研究明确.