Smad4基因静默促进PanIN细胞恶性转化相关基因的筛选及验证

摘要

背景与目的：
　　 胰腺癌恶性程度高，预后极差。我们己建立的小鼠基因打靶模型证实，KrasG12D突变启动了胰腺癌前病变胰腺导管上皮内瘤变（pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN）。Smad4基因失活可使KrasG12D突变启动的PanIN发生恶性转化。但PanIN细胞中Smad4基因静默后其下游基因表达将如何改变，进而促进PanIN细胞恶性转化，目前尚不清楚。基于此，本课题运用含有41174条小鼠基因转录本的全基因表达谱芯片，研究Smad4基因静默后PanIN细胞基因表达谱的变化。
　　 方法：
　　 1. 应用小鼠全基因芯片检测Smad4基因静默前后PanIN细胞基因表达谱的变化（即PanIN细胞与PanIN-S细胞），对差异表达基因进行分析与功能注释。并运用实时荧光定量多聚酶链反应(Real-time PCR)对部分芯片结果进行验证。
　　 2.在体外实验中，运用Matrigel肿瘤细胞侵袭试验，检测和比较Smad4基因静默前后，PanIN细胞的侵袭与迁移能力。挑选肿瘤细胞侵袭与迁移相关差异表达基因，运用Real-time PCR及免疫印迹（West Blot）进行验证。
　　 3. 动物实验中，构建PanIN及PanIN-S细胞组裸鼠移植瘤模型，绘制生长曲线，并运用Real-time PCR及免疫组化方法分析移植瘤新生血管形成相关差异表达基因的表达水平。
　　 结果：
　　 1.根据基因芯片筛选出差异倍数2倍以上的差异表达基因共237条，上调148条，下调89条。通过Real-time PCR对部分结果的验证表明，基因芯片的结果与Real-time PCR验证结果基本一致。
　　 2.肿瘤细胞侵袭实验结果显示，Smad4基因静默后的PanIN-S细胞侵袭与转移能力明显增强。Real-time PCR验证结果显示，PanIN-S细胞MMP2的mRNA水平显著高于PanIN细胞（p<0.05）；PanIN-S细胞TIMP4、PITX2的mRNA水平显著低于PanIN细胞（p<0.05）。Western Blot结果显示，PanIN-S细胞MMP2蛋白表达水平显著高于PanIN细胞（p<0.05）；PanIN-S细胞TIMP4、PITX2蛋白表达水平显著低于PanIN细胞（p<0.05）。
　　 3.动物模型结果显示，PanIN-S组的移植瘤体积显著高于PanIN组（p<0.05）；Real-time PCR验证结果显示，PanIN-S细胞PIK3CB和CXCR4 mRNA水平显著高于PanIN细胞（p<0.05）。免疫组化结果显示，PanIN-S组PI3Kinase p110 beta与CXCR4表达水平显著高于PanIN组（p<0.05）。
　　 结论：
　　 1.通过基因芯片技术筛选出Smad4基因静默前后，即PanIN细胞与PanIN-S细胞差异表达基因，为后续体内、外实验奠定了良好的基础。
　　 2.通过体外实验表明，Smad4基因静默可以促进PanIN细胞侵袭与迁移的能力。PanIN-S细胞侵袭与转移能力增强可能与MMP2高表达，TIMP4、PITX2低表达有关。
　　 3.动物模型研究表明，PanIN-S组移植瘤增殖速度快，恶性程度高。这可能与PIK3CB与CXCR4高表达，促进新生血管形成有关。

目录

前言

第一部分 Smad4基因静默前后PanIN细胞基因表达谱分析与初步验证

第二部分 Smad4基因静默对促进PanIN细胞侵袭相关基因研究

第三部分 Smad4基因静默对裸鼠移植瘤中新生血管形成相关基因研究

结论

参考文献

附录1：论著 Smad4静默前后PanIN 细胞基因芯片检测及表达谱的研究

附录2：综述 小鼠胰腺肿瘤模型的研究进展

致谢

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