慢病毒介导的RNA静默Smad4在krasG12D突变小鼠PanIN细胞中恶性转化机制的研究

摘要

目的：
　　 研究重要抑癌基因Smad4表达缺失后，对KrasG12D突变小鼠的早期PanIN(Pancreaticintraepithelial neoplasia)细胞株恶性转化机制的研究，为阐明胰腺癌的发生、发展途径和机制及靶向治疗提供新的理论依据。
　　 方法：
　　 1.根据Smad4序列设计4对miRNA序列，分别构建4条含miRNA干扰序列的真核表达质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR，转化至感受态细菌，经壮观霉素抗性、阳性克隆筛选及测序，将测序正确的质粒通过脂质体介导转染方法导入证实有Smad4表达的模型细胞株中，通过Realtime PCR和Western blot检测4对miRNA的干扰效率，筛选出最佳干扰序列构建的质粒；
　　 2.最佳干扰效率的真核质粒通过LR和BP反应构建慢病毒载体，转化至感受态菌中，经Amp抗性，阳性克隆筛选后，进行测序，将测序正确的慢病毒载体通过慢病毒脂质体介导技术与包装质粒共同转染至293FT细胞中进行慢病毒包装及纯化，在通过荧光显微镜下计数方法进行慢病毒滴度的测定后，用慢病毒感染方式导入PanIN细胞株中，通过Blasticidin的筛选，获得稳转细胞株，并通过Realtime PCR和Westernblot进行验证Smad4在感染和未感染细胞株中的表达。
　　 3.体外观察转导慢病毒载体的干扰序列的PanIN-S细胞和亲本PanIN细胞生长速度并绘制生长曲线，应用Soft agar和Transwell检测细胞的锚定非依赖性生长及侵袭能力，通过观察实验组PanIN-S细胞和亲本PanIN细胞在裸小鼠中的生长体积和瘤体重量，检测两组细胞间致瘤能力的改变，对移植瘤进行组化染色观察病理基础上的改变；
　　 4.应用基因芯片技术，筛选PanIN及PanIN-S细胞系中表达明显差异的基因，对Smad4的下游靶基因及相关功能分子进行推断。
　　 结果：
　　 设计并合成4对干扰miRNA序列，构建含4对干扰序列的质粒进行测序验证，插入片段与所设计片段序列一致，应用Realtime PCR和Western Blot检测方法，在转染的模型细胞中筛选出miRNASR61-4序列构建的pcDNATM6.2-GW/EmGFP真核质粒对Smad4抑制效率最高；
　　 构建慢病毒载体，通过测序验证插入片段与设计片段100％符合，通过脂质体介导转染技术将重组慢病毒载体及包装质粒转染至293FT细胞中，进行慢病毒包装及纯化，并通过荧光显微镜下计数方法进行慢病毒滴度测定；通过慢病毒感染方式及Blasticidin筛选建立稳定沉默Smad4表达的PanIN-S细胞系；
　　 细胞水平实验证实：PanIN-S较PanIN细胞生长速度加快(p<0.05)，锚定非依赖型能力增加(p<0.05)，侵袭能力增加(p<0.05)，两组细胞接种裸鼠后，PanIN-S细胞致瘤能力明显强于PanIN细胞(p<0.05)，且前者所致的移植瘤显微镜下恶性表现明显。
　　 通过基因芯片的检测：p值小于0.05，差异倍数大于2倍的基因共237条，其中上调基因148条，下调基因89条，对上述基因进行功能分析发现，这些表达差异的基因与细胞粘附、运动、细胞周期与凋亡、细胞生长等相关，从中进一步筛选出差异倍数大于3倍的基因共22条。
　　 结论：
　　 本研究证实了Smad4的表达缺失可以促进PanIN细胞的增殖、侵袭能力，具有促进裸小鼠的移植瘤的生长及恶性转化功能，并初步筛选出与Smad4抑癌作用相关的基因，为临床胰腺癌的防治和基因治疗提供了重要的实验依据。