弓形虫SAG1纳米抗体噬菌体文库的构建与鉴定分析

摘要

弓形虫表面抗原1(Surface antigen 1,SAG1)是虫体入侵宿主细胞的重要蛋白,与弓形虫的毒力密切相关,属于弓形虫病诊断和疫苗研究的重要候选分子.本研究表达了弓形虫RH株重组SAG1(Recombinant SAG1,rSAG1)蛋白并免疫双峰驼,分离、提取外周血淋巴单核细胞总RNA,以巢式PCR扩增骆驼重链抗体可变区(VHH),并将其连接至pHEN4载体,构建了SAG1噬菌体纳米抗体库,库容量为3.24×109cfu/mL,克隆阳性率90％.二轮淘选后富集因子为3.75×103.随机挑选40个阳性克隆测序,VHH基因编码的氨基酸序列同源性比对分析发现8个phage-ELISA值比较高的阳性克隆聚为3类.亚克隆至pMECS原核表达载体体外表达、纯化后获得8个大小约17 kDa的Anti-SAG1-Nb.免疫印迹结果显示Anti-SAG1-Nb-5能够与弓形虫天然抗原反应并产生明显的特异性条带.生物膜干涉法进一步获得该纳米抗体与SAG1的亲和常数为1.66 nmol/L.本研究首次构建了弓形虫SAG1纳米抗体库,淘选、制备并鉴定了8个Anti-SAG1-Nb,为弓形虫感染的早期检测试剂研制奠定了基础.