狂犬病人源二硫键稳定单链抗体融合蛋白的构建及活性检测

摘要

【目的】构建、表达人源二硫键稳定单链抗体(scdsFv),检测其生物活性,以获得对狂犬病病毒有特异结合能力及中和活性的scdsFv蛋白。【方法】从GenBank上获得RV单抗SO57重链可变区VH和轻链可变区VL序列,在VH44和VL100位各突变一个氨基酸为半胱氨酸,用linker连接形成scdsFv,人工合成此序列,克隆入表达载体pET22b(+),在大肠杆菌中表达目的蛋白,镍柱亲和层析法纯化,并进行SDS-PAGE、Westernblot鉴定。ELISA法和鼠脑组织抹片方法检测scdsFv对RV的特异结合活性;硫氰酸盐洗脱法测定scdsFv蛋白对RV的相对亲和力指数;分别用荧光抗体病毒中和试验(FAVN)和小鼠体内中和试验测定scdsFv的体外和体内中和活性。【结果】成功获得RV人源二硫键稳定单链抗体序列,大肠杆菌中表达得到scdsFv蛋白;分子量约为30.0kDa,Western blot表明此蛋白能与抗His单克隆抗体发生特异性反应。scdsFv能与RVVero疫苗特异结合,且结合力随抗原浓度降低而降低;scdsFv能与鼠脑组织中的RV结合。FAVN法测得scdsFv的中和效价为41IU/mL;小鼠体内中和试验表明scdsFv能保护55.6%鼠耐过强毒攻击。【结论】获得的scdsFv,具有良好的RV结合活性和体内外中和活性,有可能被用于暴露后狂犬病的预防。