LRIG2基因短发夹RNA表达载体的构建、鉴定和稳定株的筛选

摘要

目的 构建针对富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,建立稳定转染的细胞株,观察其对目的 基因表达的影响.方法 根据GenBank中LRIG2基因序列设计2条RNA干扰序列,命名LRIG2-shRNA1、LRIG2-shRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照.据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil 2载体,转化扩增后进行序列测定.用不同浓度的G418作用于GL15细胞,得到G418对于GL15细胞的筛选浓度.3种重组表达载体转染胶质瘤细胞系GL15细胞,用G418筛选后挑单克隆后扩增获得稳定株.逆转录RT-PCR和Western印迹法分别在mRNA和蛋白水平上检测LRIG2的表达.结果 3种重组表达载体(pGenesil 2-LRIG2-shRNA1、pGenesil 2-LRIG2-shRNA2和pGenesil 2-negative shRNA)经限制性酶切及DNA测序分析证明序列插入正确.G418对于GLl5细胞的筛选浓度为600μg/ml,筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞,转染pGenesil 2-LRIG2-shRNA2组细胞LRIG2 mRNA和蛋白表达明显低于转染pGenesil 2-LRIG2-shRNA1、pGenesil 2-negative shRNA组.结论 成功构建了针对LRIG2基因的shRNA表达载体(pGenesil 2-LRIG2-shRNA2),转染细胞后可抑制LRIG2基因表达,为研究LRIG2基因的功能提供了基础.