花鳗鲡脑cDNA文库的构建及GnRh日基因克隆与表达分析

摘要

以花鳗鲡脑组织为材料,提取总RNA,应用CloneminerTM文库构建试剂盒构建cDNA文库.经检测,文库的滴度为4.3×106 cfu/mL,总容量为5.16×107cfu/mL,阳性克隆率为99.6%,插入片段0.43-3.2kb之间,平均插入片段大小为1532bp.以文库为模板,克隆获得花鳗鲡两种类型的促性腺激素释放激素(mGnRH和cGnRH-Ⅱ)cDNA序列.序列分析表明,花鳗鲡mGnRH cDNA开放阅读框(ORF)包含276个碱基,编码91个氨基酸,其中包括22个氨基酸的蛋白质前体信号肽(1-22位氨基酸)、mGnRH十肽(23-32位氨基酸)、一个三肽裂解位点(33-35位氨基酸)和56个氨基酸的GnRH相关肽(36-91位氨基酸);花鳗鲡cGnRH-Ⅱ cDNA开放阅读框包含264个碱基,编码87个氨基酸,其中包括24个氨基酸的蛋白质前体信号肽(1-24位氨基酸)、cGnRH-Ⅱ十肽(25-34位氨基酸)、一个三肽裂解位点(34-36位氨基酸)和50个氨基酸的GnRH相关肽(37-87位氨基酸).序列同源性分析表明,花鳗鲡mGnRH、cGnRH-Ⅱ cDNA与日本鳗鲡之间的相似性率高达98%;与鲑形目、鲈形目、鲽形目鱼类的相似率为73%-78%;而与鲤形目鱼类的相似性相对较低(63%-67%).采用RT-PCR方法分析了两种GnRH基因在花鳗鲡雌雄个体中的表达,结果表明两基因在雌雄个体的组织表达模式无明显差异;但mGnRH基因在雌雄个体内表达部位多于cGnRH-Ⅱ的.