柑橘抗逆基因WRKY75的克隆与表达分析

摘要

[目的]低温、干旱、高盐等非生物胁迫严重限制柑橘的生长发育和地理分布.转录因子可以调控下游抗逆基因表达,在植物响应非生物胁迫的过程中起了重要的作用.WRKY是植物中重要的转录因子家族之一,其家族成员在植物抗逆过程中起着重要的作用.为研究WRKY转录因子在柑橘抗逆中的功能.[方法]以柠檬[Citrus limon(L.)Burm.f.]、甜橙[Citrus sinensis(L.)Osbeck.]、金柑[Fortunella margarita(Lour.)Swingle.]和芦柑[Citrus reticulata Blanco.]等柑橘品种的实生苗为试验材料,通过电子克隆和RT-PCR的方法从4种材料中克隆到4个新的WRKY家族基因,分别命名为ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75、CrWRKY75,并对其进行生物信息学和不同组织及胁迫处理下的表达模式分析.[结果]生物信息学分析结果显示ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75和CrWRKY75的cDNA序列全长分别为702,702,705,705 bp,分别含有582,582,585,585 bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF),分别编码193,193,194,194个氨基酸;推测其蛋白分子质量分别为21.73、21.67、21.80和21.80 ku,等电点分别是9.33、9.25、9.25和9.25,且均含有WRKY家族的保守结构域(1个WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构域).多序列比对发现,ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75和CrWRKY75蛋白与克莱门柚CcWRKY75、苹果MdWRKY75、可可TcWRKY75和葡萄VvWRKY75同源性高于90％.系统进化树分析结果表明,ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75和Cr WRKY75与克莱门柚CcWRKY75的亲缘关系最近,与烟草NtWRKY75的亲缘关系较远.亚细胞定位预测结果表明,ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75和CrWRKY75蛋白均定位于细胞核.蛋白二级结构预测结果显示,4种WRKY75蛋白含无规则卷曲结构39.18％～52.33％,α-螺旋结构29.02％～35.05％,延伸链结构10.36％～13.92％,β-转角结构8.29％～11.86％.实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)分析显示,4°C低温处理能提高4个柑橘WRKY75基因表达.而20％PEG6000模拟干旱处理只能提高FmWRKY75和CrWRKY75表达量.250 mmol/L NaCl胁迫处理只能提高CsWRKY75和FmWRKY75表达量.[结论]结果表明柠檬ClWRKY75、甜橙CsWRKY75、金桔FmWRKY75和芦柑CrWRKY75是WRKY基因家族的成员,且受多种非生物胁迫诱导表达,推测其可能在柑橘响应非生物胁迫过程中发挥了重要作用,该研究结果为进一步研究柑橘抗逆的分子机制提供理论参考.