人脐血间充质干细胞培养鉴定和慢病毒载体介导胶质源性神经营养因子在脐血间充质干细胞中的表达

摘要

目的 体外分离和培养人脐血间充质干细胞(UCB-MSCs),对其生物学特性进行鉴定.用含有胶质源性神经营养因子(GDNF)的慢病毒载体转染UCB-MSCs,初步评价基因转染后UCB-MSCs生物学功能变化,探讨GDNF在UCB-MSCs中的表达水平.方法 采用密度梯度离心法从脐血中分离单核细胞,通过贴壁培养和控制消化时间得到形态较均一的长梭形细胞,流式细胞仪(FACS)检测其细胞表面标记,诱导其向脂肪方向分化,对UCB-MSCs的生物学特性进行鉴定.将GDNF基因克隆人慢病毒载体,包装出病毒上清,以不同拷贝数转染UCB-MSCs,通过检测细胞表面抗原,观察细胞形态学和增殖分化能力的差异,初步评价基因转染对细胞生物学功能的影响.采用酶联免疫吸附实验(ELISA)和实时定量多聚合酶链反应(real-time PCR)技术分别测定不同转染组GDNF的蛋白及mRNA表达水平.结果 采用密度梯度离心法成功在体外分离和培养出UCB-MSCs,并诱导其向脂肪细胞分化.FACS检测结果显示,UCB-MSCs中CD90、CD73及CD105蛋白表达阳性,CD14、CD34、CD45、CD19、HLA-DR、Stro-1及CD106蛋白表达阴性.ELISA和real-time PCR检测结果显示,用含GDNF基因的慢病毒载体转染UCB-MSCs后,其GDNF蛋白分泌量和mRNA表达水平与转染拷贝数有关,转染拷贝数越高,GDNF表达量越高.GDNF基因转染后UCB-MSCs的原有生物学功能无明显改变.结论 成功在体外分离和培养出UCB-MSCs.用含有GDNF基因的慢病毒载体转染UCB-MSCs可通过转染拷贝数在一定水平上控制GDNF蛋白分泌量和mRNA表达水平,使其持续高表达GDNF.