慢病毒载体介导的TNF-α基因在脐血间充质干细胞中的表达的实验研究

摘要

[目的]：构建带有人TNF-α基因的慢病毒载体，并观察该基因在人脐血间质干细胞中的表达。
　　 [方法]：通过逆转录聚合酶链反应从PCDDNA-TNF-α质粒中获得人TNFα基因，利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-TNFα，在脂质体lipofectamine2000介导下与结构质粒pHelper1.0和包膜质粒pHelper2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒。将人脐血间质干细胞分为实验组(pGC-FU-TNF-α)，空载体对照组(pGC-FU-EGFP)及空白组(UCBMSCs)，分别用重组慢病毒，空载慢病毒，PBS感染后，采用RT-PCR以及Elisa检测TNF-α表达情况。
　　 [结果］：(1)所获TNF-α基因测序证明与GeneBank中序列一致；(2)重组慢病毒载体质粒pGC-FU-TNF-α经鉴定正确；(3)三质粒共转染293T细胞成功，收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107TU/L。(4)重组慢病毒感染人脐血间质干细胞后行RT-PCR检测三组细胞电泳结果显示均有TNF-αmRNA表达，其中实验组光密度值(2.71±1.57)，与空载对照组(4.63±1.32)，空白组(6.03±0.88)比较差异有统计学意义(F=1l.677，P＜0.01);ELISA检测三组细胞TNF-α浓度结果显示实验组(1.32±0.23ug/ml)与空载对照组(0.70±0.25ug/ml)，空白组(0.76±0.11ng/ml)比较差异有统计学意义(F=21.321，P＜0.01)。
　　 [结论]：(1)构建带有TNF-α基因的慢病毒载体，包装生产高滴度重组慢病毒；(2)重组慢病毒成功感染脐血间质干细胞并实现TNF-α在脐血间质干细胞中的表达；(3)转基因TNF-α脐血间充质干细胞的构建为治疗胃癌的应用奠定理论基础。