细胞角蛋白KRT18通过相互作用调控LRP16的亚细胞定位研究

摘要

LRP16是从健康成人外周血淋巴细胞中克隆的人类基因，其编码蛋白序列保守，结构简单，是Macro Domain家族成员之一，既往体外研究表明，LRP16可以与雌激素受体α(ERα)、雄激素受体(AR)、NF-κB、ERβ等核受体家族中多个转录因子相互作用。研究证明LRP16是ERa和AR的一个共激活因子。功能研究证实LRP16过表达可以促进雌激素依赖性人乳腺癌MCF-7细胞的增殖与子宫内膜癌Ishikawa细胞的侵袭生长。这些结果提示LRP16对雌激素依赖性肿瘤的发生与发展起重要作用。本研究组从MCF-7细胞cDNA文库中对LRP16候选的相互作用蛋白进行了酵母双杂交系统筛选，经两两回复验证证实KRT18与LRP16之间在酵母中的相互作用。细胞角蛋白18(cytokeratin，CK，KRT18)属于细胞骨架中间丝蛋白中的角蛋白家族成员，主要分布于细胞浆中。因此，关于LRP16与角蛋白KRT18两者之间的相互作用需要进一步证实。研究证明分化相关的细胞结构骨架蛋白与多种转录因子或转录辅激活因子在浆内存在相互作用，通过该方式将核蛋白扣留在细胞浆中，从而灭活核因子的转录活性，改变细胞的表达谱。KRT18是一个与上皮细胞分化相关的蛋白。于是我们推测KTR18可能通过与LRP16相互作用将LRP16扣留在细胞浆中，进而灭活LRP16的核功能。本研究共分为2部分：
　　 一、LRP16与角蛋白KRT18之间相互作用的研究
　　 目的：验证LRP16蛋白与角蛋白家族成员KRT18之间的相互作用以及鉴定其相互作用的分子表位。
　　 方法：
　　 ①构建KRT18全长及结构域真核表达载体。
　　 ⑦采用GST pull-down方法从体外水平上验证LRP16与KRT18的相互作用，并进一步验证LRP16与KRT18相互作用的结构域。
　　 ③用免疫共沉淀(Co-IP)体内方法验证LRP16与KRT18在体内存在相互作用。
　　 结果：
　　 ①成功构建KRT18和其结构域重组子。
　　 ②GST pull-down证明了LRP16与KRT18在体外存在相互作用
　　 ③免疫共沉淀实验结果说明内源性LRP16与KRT18的C端在体内存在特异结合。
　　 结论：
　　 ①角蛋白KRT18与LRP16存在体内体外相互作用。
　　 ②LRP16和KRT18之间相互作用区域是KRT18蛋白非螺旋化的球状C端结构域。
　　 ③LRP16通过C端唯一的结构域与KRT18相互作用。
　　 二、KRT18对LRP16亚细胞分布的影响
　　 目的：研究KRT18对LRP16亚细胞定位的影响。
　　 方法：
　　 ①构建真核表达载体LRP16-pEGFP。
　　 ②将LRP16-pEGFP质粒瞬时转染后，用荧光显微镜观察LRP16的亚细胞定位。
　　 ③LRP16-pEGFP质粒与携带KRT18基因的Flag-pCDNA3-KRT18质粒瞬时共转染，荧光显微镜观察KRT18对LRP16的亚细胞定位的影响。
　　 ④Western-Blot法进一步验证KRT18对内源性LRP16蛋白核浆分布的影响。
　　 结果：
　　 ①成功构建pEGFP-LRP16融合载体。
　　 ②荧光显微镜观察LRP16绿色荧光融合蛋白在NIH3T3细胞呈浆型分布为主，在MCF-7细胞呈核型分布为主。
　　 ③LRP16-pEGFP与KRT18共同转导NIH3T3和MCF-7细胞后荧光显微镜观察发现LRP16明显趋向于细胞浆分布。
　　 ④Western blot分析证实过表达KRT18会介导内源性LRP16由胞核趋向胞浆分布。
　　 ⑤小干扰siRNA技术证实在沉默KRT18的表达会抑制LRP16由胞核向胞浆穿梭。
　　 结论：
　　 ①LRP16在上皮性肿瘤细胞中表达产物主要分布于细胞核，是作为核因子发挥作用的。
　　 ②从细胞形态学上和蛋白水平再次证明KRT18/LRP16在活细胞内存在相互作用。
　　 ③KRT18可调控LRP16的核浆穿梭，能够将LRP16亚细胞分布趋向细胞浆。
　　 ④KRT18可以将LRP16扣留在细胞浆，是影响LRP16亚细胞分布的关键因子。