LRP16相互作用蛋白的筛选及功能调控研究

摘要

目的：①应用酵母双杂交技术筛选人乳腺癌细胞MCF-7 cDNA文库中可与LRP16相互作用的蛋白；②确认LRP16与AR等核受体及NF-κB的相互作用；③研究LRP16对AR转录活性的调控作用及其对前列腺癌细胞系LNCap在不同浓度雄激素刺激下增殖的影响；④观察雄激素对LRP16表达的调控作用。 方法：①pLPC-LRP16质粒经酶切、琼脂糖凝胶电泳、回收，获得LRP16的基因片段，将其连接至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中，经酶切验证其正确插入方向后，将重组诱饵质粒转化酵母菌AH109和Y187，并检测其在酵母中有无自激活作用和毒性。随后提取转化后的酵母总蛋白，经Western blot检测诱饵质粒在酵母中的表达情况，以鉴定其作为诱饵蛋白的可行性。②将诱饵质粒pGBKT7-LRP16、MCF-7 ds cDNA文库片段及线性化质粒pGADT7-Rec共转化酵母菌AH109，在营养缺陷型培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)上筛选阳性菌落。提取阳性克隆质粒进行PCR，将PCR产物测序，并将酵母质粒转化感受态大肠杆菌Top10获得与诱饵质粒有相互作用的单个丈库质粒，测序后回复验证其在酵母中的相互作用。③用免疫共沉淀(Co-IP)及GST pull-down等体内、体外的方法验证LRP16与AR-T-27的相互作用；进一步采用GST pull-down确认LRP16与AR等核受体及NF-κB直接的相互作用，并验证了LRP16与AR相互作用的结构域；④荧光素酶报告基因检测LRP16对AR转录激活的影响及AR对LRP16启动子的调控作用；⑤采用MTT检测抑制内源性LRP16在不同雄激素浓度刺激下对LNCap增殖的影响；⑥在不同浓度及不同作用时间点睾酮刺激下，用Western blot检测LRP16蛋白表达水平的变化及在不同前列腺癌细胞系LRP16的表达情况。 结果：①重组诱饵质粒经酶切验证，片段大小和插入方向均正确，将其转化入酵母菌后无自激活作用和毒性，Western blot证实在酵母中重组诱饵质粒可正确表达人LRP16蛋白；②获得8个与LRP16相互作用的候选蛋白，选取4个在酵母中进行回复验证，其中有3个可生长出阳性克隆；③ART-27可与LRP16相互作用，且AR、ERβ、PPARα、PPARγ等核受体及NF-κB均与LRP16有直接的相互作用；④LRP16通过唯一的C端结构域与AR的LBD域相互作用；⑤在睾酮的作用下，过表达LRP16对AR的转录活性有增强作用，抑制内源性LRP16的表达可减弱AR的转录激活活性；⑥减少内源性LRP16表达可抑制不同雄激素水平下LNCap细胞的增殖；⑦低浓度的睾酮可使LRP16蛋白表达增多，睾酮作用3h即可使LRP16蛋白表达增多，且AR对LRP16启动子活性存在增强作用；⑧AR阳性的前列腺癌细胞系LNCap比AR阴性的前列腺癌细胞系DU145中LRP16蛋白含量高。 结论：①应用酵母双杂交技术筛选出-族功能基本明确的可与LRP16相互作用的候选蛋白；②LRP16可与AR、NF-κB直接相互作用，且这种相互作用不依赖于ART-27的存在；③LRP16是部分核受体家族相互作用的蛋白因子；④雄激素反应性靶基因LRP16反馈增强AR的转录激活活性，是AR的共激活因子；⑤LRP16可能通过与AR相互作用调控雄激素敏感性前列腺癌细胞的生长。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一部分酵母双杂交技术初步筛选与LRP16相互作用的蛋白质

一、实验材料

二、实验方法

三、结 果

四、讨 论

五、结 论

参考文献

第二部分LRP16与ART-27、核受体及NF-κB相互作用的验证

一、实验材料

二、实验方法

三、结 果

四、讨 论

五、结 论

参考文献

第三部分LRP16对AR转录活性的反馈调控作用

一、实验材料

二、实验方法

三、结 果

四、讨 论

五、结 论

参考文献

文献综述 蛋白质相互作用的研究策略

攻读学位期间发表文章情况

致 谢