肝癌微波消融联合细胞免疫治疗的实验及临床初步研究

摘要

肝癌是临床进展较快的恶性肿瘤，目前主要治疗方法为手术切除、肝移植、局部消融及经动脉介入治疗。局部消融治疗小肝癌的远期疗效与手术切除相当，已被公认为是继手术和肝移植之后的根治性治疗方法之一，然而仍迫切需要探索新的疗法，以解决高转移复发率的难题。近20年来，过继性细胞免疫治疗发展迅速，有望成为肝癌的有效辅助治疗方法之一。
　　 目的:摸索微波消融治疗时有效灭活肿瘤细胞并释放肿瘤抗原的温控和能量条件；观察肝癌消融后局部注射未成熟树突状细胞对荷瘤小鼠生存期及肿瘤生长的影响；观察肝癌微波消融联合树突状细胞疫苗及效应细胞综合过继免疫治疗的临床安全性，研究微波联合细胞免疫治疗后近期外周血淋巴亚群比例及细胞因子浓度的变化，初步探讨细胞免疫治疗对肝癌微波消融后近期复发率的影响。
　　 材料与方法:
　　 1.模拟肝癌微波治疗中常用消融区边缘的温控和能量条件，消融人肝细胞癌株SMMC-7721细胞悬液，分为五组：A、对照组，B、45℃10min组，C、50℃3min组，D、54℃3min组，E、60℃即刻组，消融后30分钟及2小时进行凋亡检测。
　　 2.32只C57小鼠左例腹股沟皮下接种Hepal-6鼠肝癌细胞瘤块作为消融瘤，间隔1周，右侧腹股沟皮下接种瘤块作为观察瘤，成瘤后分为四组：A组，对照组，不行治疗；B组，微波组，仅微波消融小鼠消融瘤；C组，成熟DC组(mDc组)，微波消融小鼠消融瘤，并于小鼠双侧腋下注射肿瘤抗原致敏的树突状细胞；D组，未成熟DC组(iDC组)，微波消融小鼠消融瘤，并于消融瘤周注射未成熟树突状细胞。观察瘤均不予处理，荷瘤后每7—8天测量瘤体大小，直至小鼠死亡。
　　 3.知情同意原则下，10例行根治性微波消融联合多种免疫细胞过继治疗的原发性肝癌患者纳入联合组，同期符合相同入组条件的121例微波治疗患者纳入微波组。联合组患者免疫治疗方案设计为三个疗程，治疗前抽血45ml用于分离培养DC和效应细胞，在超声造影引导下回输到肝内消融区与充血带交界区或在超声引导下回输到腹股沟淋巴结内及右上腹腹腔内。10例联合组及24例微波组患者还于治疗前及治疗后1、3、6个月进行外周血淋巴细胞亚群及细胞因子检测。
　　 结果:
　　 1.体外实验：受微波热损伤细胞主要表现为死亡，凋亡细胞比例小；在各温控和能量条件下，随温度升高，存活细胞百分比降低，消融后2h与30min比，各消融组存活细胞比例显著降低，其中60℃即刻组94.36％细胞均死亡或凋亡，其它组仍有较多存活细胞。
　　 2.体内实验：消融后12天，各治疗组消融瘤最大径均显著小于对照组，但治疗组问无显著差异，观察瘤最大径亦显著小于对照组且iDC组明显小于mDC组(p<0.05)；各治疗组小鼠观察120天，消融瘤原位灭活率均为37.5％，iDC组(87.5％)及mDc组(75％)观察瘤消失率均高于单纯微波组(62.5％)，iDC组最高；与对照组相比，各治疗组小鼠生存期显著延长，iDC组最长；iDC组及mDC组生命延长率高于单纯微波治疗组，iDC组最高。
　　 3.临床研究：微波联合免疫治疗54次细胞回输未出现II级以上严重不良反应，治疗后1、3、6个月患者血常规、肝肾功能及凝血功能与治疗前比较均无显著差异。患者经微波消融联合免疫治疗后1、3、6个月，外周血CD8+CD28+淋巴细胞亚群百分比较治疗前升高并显著高于微波组，CD4+/CD8+较治疗前降低并显著低于微波组；治疗后1和3个月，CD8+CD28-效应细胞亚群百分比较治疗前显著升高；治疗后1个月，CD4+CD25highTreg细胞百分比较治疗前显著降低，并显著低于微波组，治疗后3和6个月时，虽仍低于治疗前但有所回升，且与消融组无差异。治疗后1个月，联合组IL-2浓度及IL-2/IL-4值较治疗前增高，治疗后3和6个月时回落。联合组患者治疗后3-9月内局部肿瘤进展率及肝内复发或肝外转移率均较微波组有降低趋势，但尚无统计学差异。联合治疗后1个月，57.14％患者产生了病毒应答。
　　 结论
　　 1)微波消融肿瘤细胞达到60℃，静置2小时，94.36％肿瘤细胞死亡或凋亡，推测该温控条件及时间点是消融区边缘未成熟树突状细胞回输治疗的较好选择；
　　 2)肝癌微波消融联合消融区边缘注射未成熟DC，可延长小鼠生存期，并可使远处肿瘤灶明显缩小甚至消退；
　　 3)微波消融联合树突状细胞和效应细胞过继免疫治疗肝癌在临床实施中是安全的；
　　 4)联合治疗改善了机体免疫状态，并可实现较高的病毒应答率，但是持续时间有限，提示现有治疗方案需要缩短时间间隔、增加疗程，并有必要进行抗病毒免疫治疗改善患者整体免疫状况，临床疗效尚需扩大病例数延长随访期后进一步评价。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词表

声明

前言

1.课题研究背景

2.实验及临床研究

2.1 不同温控条件下微波消融肝癌细胞株后细胞状态的体外实验研究

2.1.1 研究目的

2.1.2 材料和方法

2.1.3 结果

2.1.4 讨论

2.2 肝癌微波消融后树突状细胞过继免疫治疗的体内实验研究

2.2.1 研究目的

2.2.2 材料和方法

2.2.3 结果

2.2.4 讨论

2.3 肝癌微波消融联合树突状细胞疫苗及效应细胞过继治疗的初步临床研究

2.3.1 研究目的

2.3.2 材料和方法

2.3.3 结果

2.3.4 讨论

3.总结与展望

参考文献

附 图

文献综述 肝癌免疫治疗临床研究进展

攻读博士学位期间发表文章情况及个人简历

致 谢