MiR-132抑制SIRT1调控SREBP-1c通路并诱导血管内皮细胞炎症反应的机制研究

摘要

背景:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是临床心脑血管疾病的病理基础,严重威胁着人类健康。有研究证实,在AS形成的各个阶段中炎症都参与并起关键作用。AS的发生与脂代谢及内皮细胞炎症直接相关。MicroRNA(miRNA, miR)可通过抑制SIRT1相关的炎症反应有望用于治疗AS,但是相关机制仍不清楚。
　　目的:探讨MiR-132抑制SIRT1调控脂代谢过程,进而诱导血管内皮细胞炎症导致动脉粥样硬化的机制。
　　方法:明确调控SIRT1的miRNAs,并进一步在脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中下调其下游脂代谢相关调节基因 SREBP以及脂质和胆固醇代谢途径。
　　结果:在转染了miR-132的脐静脉内皮细胞中,SIRT1的3’ UTR荧光素酶活性明显减低(0.338±0.036)(P=0.000)。Western blot检测SIRT1,SREBP-1c及其下游的FASN、HMGCR蛋白表达水平明显下调。qRT-PCR分析显示转染miR-132的脐静脉内皮细胞中,SIRT1(0.53±0.06)、及SREBP-1c(0.45±0.07)、FASN(0.55±0.09)、HMGCR(0.62±0.08)表达水平减低。在给予不同浓度TNF-α处理HUVECs中,sICAMI的水平随TNF-α的浓度增高而增高,ICAMI及MMP9的蛋白水平也成剂量相关。经转染miR-132或其抑制剂48小时,分别给予或不给予TNF-α处理4小时后,miR-132组较抑制剂组的炎症因子水平明显增强。给予miR-132抑制剂后,SIRT1、SREBP-1c及其下游调控基因FASN和HMGCR的基因表达及蛋白水平均有增高。对于内皮细胞功能检测中,转染了miR-132的HUVECs,增殖、活性及迁移均有减低,而细胞凋亡则增加,尤其是TNF-α预处理组。
　　结论:SIRT1是miR-132的直接靶基因。MiR-132在脐静脉内皮细胞中通过抑制SIRT1、SREBP-1c及其下游调控基因FASN和HMGCR,从而进一步调控细胞内脂质和胆固醇合成,造成血管内皮细胞脂代谢紊乱,促进炎症过程及血管内皮损伤。

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前言

第一部分MiR-132抑制脐静脉内皮细胞中SIRT1及SREBP-1c代谢通路相关基因表达的研究

研究背景

材料和方法

1．试剂和仪器设备

2.人脐静脉内皮细胞的培养

3.台盼蓝细胞拒染试验

4．HUVECs总RNA的提取

5．MiRNA-132及U6内参cDNA的制备

6．SIRT1、SREBP-1c、FASN、HMGCR及GAPDH的cDNA制备

7．Real-time PCR扩增

8．琼脂糖凝胶电泳证实ReaI-Time PCR扩增后产物

9．细胞总蛋白的抽提

10． BCA法蛋白浓度测定

11．Western-blot试验

12. 统计学分析

结果

1. miRNA-132可调控SIRT1的表达：

2. MiR-132可调控SIRT1及其下游SREBP-脂质合成-胆固醇合成代谢通路中基因的表达水平：

3. Mir-132 促进TNF诱导HUVECs细胞炎症反应：

讨论

结论

局限性与不足

参考文献

第二部分MiR-132通过抑制SIRT1及SREBP-1c代谢通路促进血管内皮细胞炎症以及对细胞生物学功能的影响

研究背景

材料和方法

1.细胞胆固醇抽提

2.细胞胆固醇含量测定

3.细胞内甘油三酯含量测定

4.CCK8法检测细胞增殖/细胞活性：

5. 细胞凋亡检测：

6.Transwell细胞迁移实验：

7.统计分析

结果

1．MiR-132抑制HUVECs细胞胆固醇和脂肪酸合成：

2．MiR-132对HUVECs细胞增殖、细胞活性、细胞迁移和细胞调亡的影响：

讨论

结论

局限性与不足

参考文献

综述

攻读学位期间发表论文情况

致谢