血管内皮特异性因子DLL4在肾细胞癌肿瘤生长，侵袭，血管生成及血行转移中的作用

摘要

目的:肾细胞癌是富血供肿瘤，其发生和进展与肿瘤血管生成(angiogenesis)密切相关。目前研究表明大多数肾细胞癌出现抑癌基因VHL(Von-Hippel-Lindau)突变，该突变基因产生的蛋白失去了降解缺氧诱导因子HIF(Hypoxia InducibleFactor)的功能从而引起下游因子血管内皮生长因子VEGF(Vascular EndothelialGrowth Factor)过度表达而导致肿瘤血管生成，从而促进肿瘤快速生长和转移。因此，目前转移性肾细胞癌的一线治疗药物为阻断VEGF信号通路的靶向治疗。但是，靶向治疗治疗的总体有效率为30-50％，即相当一部分肾细胞癌耐受抗VEGF治疗，而且经过靶向治疗的肾细胞癌后期逐渐出现耐药的情况。这些临床现象提示，除了VEGF信号通路之外，尚有其他机制影响肿瘤血管生成。血管内皮特异性因子DLL4被证实与血管生成密切相关且与VEGF信号通路既相关又独立，除了VEGF之外，调节DLL4的其他机制研究较少。再者，DLL4除了影响肿瘤血管生成外，直接影响肾细胞癌的增殖及侵袭等生物学行为知之甚少。基于此提出假设:DLL4可能通过影响内皮细胞的血管生成及肿瘤细胞的增殖与转移而发挥双重作用而影响肾细胞癌的血行转移。本课题的研究目的:①研究DLL4对肿瘤血管生成的作用及相关机制;②研究DLL4对肾细胞癌的发生及侵袭等生物学行为的影响及下游信号通路;③研究DLL4对肾细胞癌血行转移的影响及临床意义。
　　方法:①运用real-time PCR，western blot及免疫组化技术检测DLL4及相关基因在120例肾细胞癌组织及28例癌旁组织的信使RNA(mRNA)及蛋白表达水平，并运用单因素及多因素模型分析这些基因表达量与标本临床病理学参数的关系;②通过流式细胞仪及增殖实验MTS方法检测DLL4对脐静脉内皮细胞HUVEC及肾细胞癌细胞769-P、786-O、caki-1细胞增殖的影响，另外通过transwell方法检测DLL4对HUVEC及上述肾细胞癌细胞株侵袭能力的影响;通过上述实验明确DLL4对肿瘤细胞生长，侵袭及内皮细胞血管生成的影响;③通过生物信息学预测的方法找出作用于DLL4的microRNAs，并通过荧光素酶实验(luciferase assay)、westemblot及功能学实验验证该miRNA是否能调控DLL4并且影响其功能;通过与高表达DLL4的细胞共培养及加入重组人DLL4蛋白(rDLL4)的方法调节DLL4水平后找出肿瘤细胞内其下游靶基因，并通过在临床标本中表达相关性验证它们是否有临床意义;④对入组患者进行随访，分析DLL4表达高低与肿瘤的血行转移及靶向治疗耐药之间是否存在关联。
　　结果:①DLL4在肾细胞癌中的袁达高于癌旁组织，而且特异性表达于肿瘤血管内皮;DLL4、微血管密度及DLL4表达密度（相对于血管内皮细胞数量的表达）在发生血行转移的肿瘤组织中的表达均高于淋巴转移的肿瘤组织及非转移肿瘤的组织的表达，差异有统计学差异;DLL4表达与血管密度均肿瘤分类相关，在透明细胞癌中的表达高于乳头状细胞癌及嫌色细胞癌中的表达，而DLL4表达密度与肿瘤分类无关，而与肿瘤血管密度相关;运用logistic多因素分析模型发现肿瘤的血行转移不仅与肿瘤大小及微血管密度有关，而且与DLL4表达密度相关。②在内皮细胞HUVEC中过表达DLL4后其细胞增殖及侵袭能力均增加，而共培养高表达DLL4的细胞或添加rDLL4后，肾细胞癌细胞株769-P、786-O和caki-1细胞增殖及侵袭能力也增强;DLL4通过影响肿瘤细胞周期而影响细胞增殖能力。③生物信息学预测DLL4为miR-30a的靶基因，通过荧光素酶实验及功能实验验证发现miR-30a通过作用于mRNA3'UTR下调DLL4的表达并影响其对血管内皮细胞HUVEC的作用;共培养高表达DLL4的细胞或添加rDLL4后，Notch信号通路被激活，通过下游靶因子Hey1促进MMP9的表达，从而增强肿瘤细胞的侵袭能力。④经过4年的随访发现miR-30a及DLL4的表达密度高低与肿瘤术后发生血行转移相关，而且DLL4表达密度高的肿瘤对抗VEGF靶向治疗更加敏感。
　　结论:①血管特异性蛋白DLL4促进肾细胞癌生长、侵袭及血管生成而促进肿瘤的血行转移。②机制研究表明DLL4通过激活肾细胞癌肿瘤细胞Notch/Hey1/MMP9信号通路而发挥作用。③肾透明细胞癌中低表达的miR-30a通过上调靶基因DLL4而促进肿瘤血管生成，并最终影响肾细胞癌血行转移。④DLL4的表达与靶向药物治疗效果相关，抑制DLL4/Notch/Hey1/MMP9信号通路可能成为新的治疗靶点，联合抗VEGF靶向药物可能提高治疗效果。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 DLL4在肾细胞癌中的表达

1．材料与方法

2．结果

2．1 120例肾细胞癌肿瘤组织的临床病例特点

2．2 DLL4在肾细胞癌中的表达部位

2．3 DLL4／Notch信号通路在肾细胞癌组织及细胞株中的表达

3．小结

第二部分 DLL4与肾细胞癌血行转移的关系

1．材料与方法

2．结果

2．1 DLL4的表达与肿瘤病理特点的关系

2．2 DLL4对肾细胞癌血行转移及靶向治疗有效性的预测作用

3．小结

第三部分 DLL4与肾细胞癌肿瘤生长的关系

1．材料与方法

2．结果

2．1 DLL4及血管密度在肾细胞癌生长过程中的临床意义

2．2 DLL4／Notch信号通路促进肾细胞癌肿瘤细胞增殖

2．3 DLL4／Notch信号通路与肾细胞癌肿瘤细胞周期的关系

3．小结

第四部分 DLL4与肾细胞癌肿瘤细胞侵袭能力的关系

1．材料与方法

2．结果

2．1 DLL4促进肾细胞癌肿瘤细胞侵袭能力

2．2 DLL4下游信号通路

3．小结

第五部分 miR-30a调控DLL4并影响肾细胞癌血管生成

1．材料与方法

2．结果

2．1 miR-30a调控DLL4并影响内皮细胞增殖及侵袭能力

2．2 miR-30a及DLL4与肾细胞癌血管密度的关系

2．3 miR-30a与肾细胞癌血行转移的关系

3．小结

讨论及结论

参考文献

综述：晚期肾癌的转移机制及治疗方式

英文略缩词表

攻读学位期间发表论文

致谢