加减驻景方对Akt基因转染后ARPE-19细胞表达VEGF的影响及机制研究

摘要

研究目的:
　　1.观察加减驻景方含药血清对Akt转染后ARPE-19细胞增殖的影响。
　　2.探讨加减驻景方含药血清对Akt转染后ARPE-19细胞培养上清液中VEGF含量的影响，并观察其对ARPE-19细胞Akt、mTOR和HIF-1a因子表达的影响，初步探讨加减驻景方抑制CNV形成的分子通路机制。
　　研究方法:
　　1.体外培养ARPE-19细胞，取生长良好的细胞用于实验，分为正常组、空白血清组、含药血清组、康柏西普组并设立不同干预浓度及观测时间。
　　2.CCK-8法检测各组血清及药物对细胞活性的影响。
　　3.将重组表达质粒pcDNA3.1-AKT以脂质体介导的方法转染ARPE-19细胞，建立Akt基因转染ARPE-19细胞模型。
　　4.用免疫印迹法(Western Blot)检测验证模型细胞构建成功。
　　5.体外培养ARPE-19模型细胞，取生长状态良好用于实验，分为正常组、模型组、模型细胞干预组（空白血清组、含药血清组、康柏西普组），并设立不同干预浓度及观测时间。
　　6.CCK-8法检测各组对转染模型细胞活性的影响。
　　7.用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组转染模型细胞上清中VEGF生长因子的表达。
　　8.用实时定量PCR（RT-PCR）法检测各组转染模型细胞中AKT、mTOR、HIF-1a、VEGF基因(mRNA)的表达情况。
　　9.用免疫印迹法(Western Blot)检测各组转染模型细胞中AKT、mTOR、HIF-1a、VEGF蛋白表达的情况。
　　研究结果:
　　1.不同浓度的空白血清组、含药血清组培养ARPE-19细胞24h后，各组细胞活性与正常组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，对细胞生长无毒性;各组作用ARPE-19细胞48h及72h后血清高浓度组(20％、40％)细胞活性低于正常细胞组(P＜0.05)，而2.5％、5％、10％血清浓度对细胞活性影响不大(P＞0.05);康柏西普药物组各浓度作用细胞24h、48h、72h后，仅20μg/ml浓度与正常组比型组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，说明含药血清及康柏曲普对Akt过表达后细胞中HIF-1αmRNA的表达量无明显影响。
　　6.Western Blot法检测显示:正常培养24h和48h的转染模型组细胞Akt、mTor、VEGF蛋白表达量显著高于正常细胞组(P＜0.05)，说明Akt转染ARPE-19细胞后，细胞中Akt、mTor、VEGF蛋白表达增加;空白血清组与转染模型组比较无统计学意义(P＞0.05);含药血清组、康柏西普组与转染模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05);康柏西普组细胞中各因子含量小于含药血清组，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明含药血清及康柏西普可抑制Akt过表达后细胞中Akt、mTor、VEGF蛋白的表达量;正常培养24h和48h的转染模型组细胞中HIF-1α蛋白表达量和正常细胞组比较无明显差异(P＞0.05)，空白血清、含药血清及康柏西普组与模型组比较没有显著性差异(P＞0.05)，说明含药血清及康柏西普对Akt过表达后细胞中HIF-1α蛋白的表达量无明显影响。
　　研究结论:
　　1.Akt基因转染后可诱导ARPE-19细胞的增殖，增加细胞中AKT、mTOR、VEGF mRNA及蛋白的表达;
　　2.加减驻景方含药血清对Akt转染后ARPE-19细胞的增殖及AKT、mTOR、VEGF mRNA及蛋白的表达有抑制作用;
　　3.加减驻景方可能是通过抑制AKT的活化，调控AKT/mTOR/VEGF通路而抑制VEGF的表达，从而抑制或延缓CNV的形成。

目录

声明

摘要

中英文缩略词

综述 脉络膜新生血管的中西医诊治进展

前言

第一部分 加减驻景方对Akt转染后ARPE-19细胞增殖活性的影响

第一节 加减驻景方含药血清对ARPE-19细胞活性的影响

1 材料

2．方法

3 结果

4 小结

第二节 加减驻景方含药血清对Akt转染后ARPE-19细胞增殖活性的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 小结

第二部分 加减驻景方含药血清对Akt转染后ARPE-19细胞表达Akt、mTOR、HIF-1α、VEGF的影响

1 材料

1．1 动物及细胞

1．2 药物

1．3 主要试剂及配制

1．4 主要的仪器

2 方法

2．1 加减驻景方含药血清的制备

2．2 细胞培养

2．3 实验分组及给药

2．4 ELISA法检测各组对转染后ARPE-19细胞培养上清液中VEGF蛋白表达的影响

2．5 Real time-PCR法检测各组对Akt转染后ARPE-19细胞中Akt、mTOR、HIF-1α及VEGF mRNA转录水平

2．6 Western-blot法检测各组对Akt转染后ARPE-19细胞中Akt、mTOR、HIF-1α及VEGF蛋白表达量的影响

2．7 统计学分析

3 结果

3．1 ELISA法检测分析

3．2 Real time-PCR法检测分析

3．3 Western-blot法检测分析

4 小结

讨论

1 中医对CNV的认识

2 西医对CNV的认识

3 加减驻景方的立方依据

4 CNV形成的分子机制

5 加减驻景方对CNV生成的作用机制探讨

5．1 细胞模型的建立和思考

5．2 加减驻景方对模型细胞作用的机制探讨

6 不足与展望

结论

参考文献

附图

致谢

作者简历