具有高效同源定向修复活性的CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合体的分子设计和递送方法研究

摘要

2020年的诺贝尔化学奖授予了法国科学家埃曼纽尔·卡彭蒂耶和美国科学家詹妮弗·杜德纳,以表彰她们开发出一种名为CRISPR/Cas9的基因组编辑技术。这项技术首次让人们能够高效率地编辑基因序列,更直观地去研究基因的功能,在生命科学研究的各个层面展现出革命性的推动力。但是,准确性和安全性是目前限制该系统在活体内应用的最主要问题。本研究选择转染剂量可控、半衰期短的Cas9核糖核蛋白复合体(RNP)进行基因组编辑研究,以期开发出能够精准编辑细胞基因组的新方法和新技术。本课题首先开发了一种生产成本低、生物相容性好的纳米颗粒递送材料,能够将Cas9 RNP和DNA修复供体同时高效地递送进细胞,实现同源定向修复(HDR)介导的精准修复。采用实验室开发的“生物自组装方法”,我们制备了N端含有谷氨酸多肽(Etag)标签的Etag-Cas9 RNP。该RNP富含负电荷,能够与壳聚糖包裹的红色荧光蛋白以及单链DNA(ss DNA)修复模板通过静电相互作用自组装成200 nm左右的纳米颗粒。该方法实现了77.6%的递送效率和12.5%的HDR介导基因组编辑效率,同时在多种细胞系中产生了有效的基因组编辑。相较传统的脂质体递送方法,该方法不仅具有相当的递送效率和编辑效率,而且制备方法简便、生物相容性好,具有广泛的应用前景。研究表明,在自然条件下由基因编辑产生的双链断裂(DSBs)绝大部分经非同源末端修复(NHEJ)途径得以修复。但该过程常在基因组上删除或者插入部分碱基,造成不可控的修复结果。与之相反,能够产生精准修复的同源定向修复(HDR)途径的效率往往很低。本研究针对Cas9 RNP进行分子设计和优化,在g RNA的3′端引入可抑制NHEJ途径关键因子Ligase 4基因的sh RNA碱基序列;将Cas9基因编辑技术和RNAi干扰技术相融合,构建出Cas-RNAi RNP以提高HDR效率。目前,验证细胞基因组HDR效果的实验仍在重复和优化中。总之,本研究的成果将为实现Cas9 RNP在基因治疗领域的大规模应用提供理论指导和技术基础。

目录

摘要

abstract

第1章 研究背景与文献综述

1.1 CRISPR/Cas9 系统简介及其在基因编辑领域的应用

1.1.1 CRISPR/Cas9 系统简介

1.1.2 CRISPR/Cas9 系统在基因编辑领域的应用

1.2 CRISPR/Cas9 系统的递送方式

1.2.1 质粒形式的递送方法

1.2.2 mRNA形式的递送方法

1.2.3 核糖核蛋白复合体形式的递送方法

1.3 DNA双链断裂的修复途径与提高同源介导修复途径效率的方法

1.3.1 DNA双链断裂的修复途径

1.3.2 提高同源重组修复途径效率的方法

1.4 本研究的意义

第2章 利用壳聚糖包裹荧光蛋白的纳米颗粒向细胞内递送Cas9 RNP进行基因组编辑

2.1 实验设计

2.2 实验材料

2.2.1 菌株、质粒与细胞系

2.2.2 主要试剂材料及溶液的配制

2.2.3 培养基的配制

2.2.4 本章所用引物

2.2.5 实验仪器与设备

2.3 实验方法

2.3.1 Etag-Cas9 RNP表达质粒的构建

2.3.2 Etag-Cas9 RNP的表达、纯化及离体酶切活性检测

2.3.3 FITC标记蛋白

2.3.4 纳米颗粒复合物的合成与装配

2.3.5 细胞转染实验

2.3.6 流式细胞术

2.3.7 细胞基因组的提取及T7E1 实验

2.3.8 细胞毒性实验

2.4 实验结果

2.4.1 Etag-Cas9 RNP的纯化和离体活性测试

2.4.2 壳聚糖包裹红色荧光蛋白纳米颗粒RFP@CS的表征

2.4.3 Cas9 RNP-RFP@CS复合物的表征

2.4.4 RFP@CS向胞内高效递送Etag-Cas9 RNP

2.4.5 Etag-Cas9 RNP编辑细胞内基因组的效率

2.4.6 纳米颗粒细胞毒性测定实验

第3章 “sgRNA-sh RNA”Cas9 RNP的分子设计及其用于细胞基因组的高效HDR修复

3.1 实验设计

3.2 实验材料

3.2.1 菌株、质粒与细胞系

3.2.2 主要试剂材料及溶液的配制

3.2.3 本章所用引物

3.2.4 实验仪器与设备

3.3 实验方法

3.3.1 “sgRNA-sh RNA”Cas9 RNP表达质粒的构建

3.3.2 “sgRNA-sh RNA”Cas9 RNP的表达、纯化及离体酶切活性检测

3.3.3 聚丙烯酰胺凝胶核酸电泳

3.3.4 细胞转染实验

3.3.5 流式细胞术

3.3.6 细胞总RNA的提取

3.3.7 RT-q PCR实验

3.3.8 TIDER法分析HDR效率

3.4 实验结果

3.4.1 “sgRNA-sh RNA”Cas9 RNP的纯化和离体活性测试

3.4.2 核糖核蛋白复合物中含有完整的sgRNA-sh RNA结构

3.4.3 sh RNA对靶标基因的沉默作用

3.4.4 “sgRNA-sh RNA”Cas9 RNP能够提升基因组编辑的HDR效率

总结与展望

4.1 工作总结

4.2 工作展望

参考文献

附录

致谢