戊型肝炎病毒4型ORF2片段在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

摘要

戊型肝炎病毒（HEV）为无包膜的单股正链 RNA病毒，基因组全长约7200bp，有3个开放读码框架（ORFs）：ORF1、ORF2和ORF3。感染哺乳动物的HEV主要有4个基因型，只有一个血清型。
　　昆虫杆状病毒表达系统具备许多真核系统翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化、磷酸化、信号肽切除等。应用其不但能表达大分子蛋白还可以同时表达多个外源基因，形成多聚体蛋白。表达出的重组蛋白具有天然蛋白的生物学功能，最高表达量可达细胞总蛋白量的50％。
　　利用昆虫杆状病毒表达系统表达的HEV ORF2蛋白能自主组装成病毒样颗粒（VLPs），这些VLPs不仅在形态大小上与天然的病毒颗粒非常相似，而且免疫原性与完整的HEV类似，为戊型肝炎疫苗及诊断试剂的研究奠定了基础。
　　本课题针对戊型肝炎病毒（HEV）4型ORF2编码第126-621位氨基酸的基因进行 PCR扩增，构建克隆，并应用昆虫杆状病毒表达系统进行表达。对所表达的蛋白进行纯化分析，电镜观察确定是否形成病毒样颗粒。
　　一．重组杆状病毒转移载体的构建与鉴定
　　为了提高病毒样颗粒的产量，对HEV ORF2基因进行 PCR扩增时引入Kozak序列。以本室构建的质粒为模板，PCR扩增得到优化后的目的基因，经过酶切连接最终得到pFastBac1重组载体，经过DNA测序验证序列及读码框正确。
　　二．病毒样颗粒的表达与纯化
　　利用Bac-to-Bac表达系统，在 Sf9昆虫细胞内表达目的基因。ELISA与Western Blot检测显示：目的蛋白表达量较高，具有抗原性；免疫荧光检测显示：目的蛋白为胞内表达；利用多种纯化方法纯化目的蛋白，纯度在90%以上；电镜观察显示：HEV病毒样颗粒为球形颗粒，直径约为30-40nm，比天然病毒颗粒略大。

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前 言

第一部分 戊型肝炎病毒4型ORF2片段在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

原理及技术路线

材料与方法

一． 材料

二． 方法

结 果

一．重组pFastBac1载体的构建

二．PCR分析确定包含重组杆粒的阳性克隆

三． 昆虫细胞感染后所发生的病变如图1-10所示：

四． 重组蛋白的初步表达

五．感染条件的优化

第二部分 HEV结构蛋白的纯化工艺研究

技术路线

材料与方法

一．材料

二．方法

结 果

一．Sf9昆虫细胞的大量培养及病毒样颗粒在其中的表达—MOI（感染复数）的

二．软件分析目的蛋白

三．目的蛋白纯化方案的选择及初步鉴定

四. 目的蛋白的鉴定与检测

讨 论

一．昆虫杆状病毒表达系统

二．病毒样颗粒（VLPs）

三． HEV结构蛋白在昆虫细胞中形成病毒样颗粒（VLPs）的形态学分析

四．病毒样颗粒（VLPs）的免疫原性及应用

五．病毒样颗粒（VLPs） 的纯化工艺的选择

五． 课题展望

小 结

参考文献

综 述

英文缩略词

硕士期间论文发表情况

致谢

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