HCV变异血清学检测技术初步研究及小样本临床评价

摘要

由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染引起的丙型肝炎是一种十分严重的传染性肝脏疾病，感染者70％慢性化，并进一步发展为肝硬化和肝细胞癌[1-3]，给我国公共卫生事业带来了极大的危害。
　　目前对HCV的临床治疗，主要是采用长效干扰素（interferon，IFN）和利巴韦林进行的联合治疗[4]，但存在费用高、周期长、治愈率低的问题，对患者开展有针对性的个体化治疗得到医学界的广泛支持[5]。但仅根据 HCV基因分型、病毒载量确定相应的治疗方案远不能满足临床个体化治疗的需求。故本研究目的在于：建立一种HCV辅助检测技术----丙型肝炎病毒变异的血清学检测技术，通过HCV患者体内抗变异株抗体的变化，分析患者体内病毒的变异程度，并进一步评价该技术在指导临床用药和预后判断中的作用，为HCV患者提供新的个体化治疗评价手段。
　　HCV是一种单股正链RNA病毒，1989年首次克隆成功，其基因组全长约9.5kb[6]。由于RNA酶缺少校对功能，整个基因组呈现高度的变异性[7]，目前HCV至少分为6个基因型和80多种以上的亚型。HCV的变异除了可以形成不同的基因型和亚型之外，还重点体现在准种变异上，即在同一感染者体内存在以一条序列为主的多种变异序列共存的病毒群体[8]。研究显示：HCV准种变异的复杂程度与干扰素治疗效果和临床转归预后密切相关，因此，应将准种变异作为指导临床治疗的另一项重要指标[9-10]。
　　衡量HCV准种变异复杂程度通常采用的靶序列为位于E2区N端的第一高变区（hypervariable region1，HVR1），目前已经发展了克隆测序、单链构象多态性分析（Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）、限制酶切分析（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）等方法，通过对HVR1基因复杂程度的分析，反映 HCV整个基因组的变异情况。但上述方法离不开“HCV-RNA的提取—逆转录—PCR”三大环节，时间长、费用高，难以推广于临床。
　　本研究以HCV变异最大的HVR1为研究靶点，利用生物信息学手段，平行对上千条 HVR1抗原及模拟肽序列进行筛选，获得具有HCV变异株代表性的HVR1抗原组合，并以此为基础，建立适合临床推广的HCV变异的血清学检测技术，满足HCV个体化治疗的需求。
　　本研究初步建立了HCV变异的血清学检测技术，并进行了小样本的临床评价。具体结果简述如下：
　　首先，通过Genbank、文献调研、自主钓取获得了1,600条HVR1序列，采用本室自主开发的VB序列分析软件 Biodesign构建 HVR1变异数据库。在对HVR1变异数据库中的1,600条序列进行总体分析的基础上，按照30%的变异频率，分组进行同源比较序列筛选，最终筛选到30条HVR1变异代表序列。
　　按照大肠杆菌表达外源基因的优势密码子，人工合成了30条代表性HVR1基因的寡核苷酸片段。将其分别克隆到pBVIL1载体上，通过温控诱导，30条代表性 HVR1多肽在大肠杆菌中均获得高效表达，重组 HVR1多肽的分子量为21KD左右，经过超声破碎，SDS-PAGE显示，主要以包涵体形式表达，进一步将包涵体蛋白分离、洗涤，溶于8M脲中，采用离子交换及凝胶过滤对其进行纯化。
　　我们从北京、西安、河北固安、杭州、岳阳、泰安、长春等处共收集 HCV阳性血清50份，建立本研究的全国HCV变异检测panel，用上述纯化的30条代表性重组HVR1抗原包被96孔板，采用ELISA法，对纯化后变异抗原的活性进行鉴定。所筛选的HVR1抗原的交叉反应率在26.0%~38.0%之间。综合考虑HVR1准种抗体检测特异性及保证一定的灵敏度情况下，我们选取了编号为1，2，4，6，9，11，14，15，16，18，19，21，22，23，25，27共16条HVR1抗原作为多靶点组合，来检测HVR1抗体的变化情况，该组合能覆盖所有代表HVR1抗原与血清的交叉活性，其总的覆盖面为95.0%（49/50）。
　　在上述多靶点 HVR1抗原组合的基础上，我们设计了含有IgG阳性对照和表达空载体IL-1阴性对照在内的9×6芯片矩阵，建立了HCV变异血清学检测技术，并采用方阵滴定法，优化反应条件。
　　为了评价HCV变异血清学检测技术与克隆测序金标准法之间的相关性，采用HVR1克隆测序法和HCV变异血清学技术对14位HCV患者体内准种的变异情况进行检测，统计显示：HCV变异血清学检测法与测序法检测结果之间相关系数 r=0.747（P<0.01）,提示可采用HCV变异血清学检测法对患者体内准种的变异情况进行检测。
　　评价了HCV变异的血清学检测在疾病转归和预测中的作用，采用该技术对23份无症状、18份慢性肝病变、16份肝硬化HCV感染者进行检测，结果显示：这3组患者 HCV血清中 HVR1抗体变异数目分别为3.09±2.68、5.72±3.83、7.44±3.90；统计显示，慢性和肝硬化患者组的HCV变异程度要显著高于急性患者组（P<0.01），提示HCV变异血清学检测可能是一种新的HCV疾病转归标记物。
　　评价了HCV变异的血清学检测在预测IFN治疗效果中的作用，我们采用该技术对HCV临床治疗患者进行检测，结果显示：干扰素有效应答组的患者变异数目为3.91±3.09，而无效及复发患者变异数目为12.48±3.12；无效及复发组中HCV-HVR1变异程度要显著高于有效应答组（P<0.01），提示可以根据HCV-HVR1变异的血清学检测对患者的治疗效果做出预测，有助于临床开展更有针对性的个体化治疗。
　　综上所述，本研究在对HCV-HVR1序列生物信息学分析筛选的基础上，综合利用基因重组、克隆表达、血清学检测、免疫芯片等技术，初步建立了HCV-HVR1变异的血清学检测技术，通过检测HCV血清中HVR1抗体的变化情况，反映HCV患者体内准种变异的复杂程度，无需进行HCV-RNA提取和RT-PCR等操作，简单实用，易于在临床推广。小样本临床评价结果提示该技术可用于HCV转归和预后、IFN疗效预测的研究，具有一定的临床应用前景。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

前言

一、丙型肝炎病毒变异的研究

二、丙型病毒性肝炎诊断与治疗的研究

第一部分 HCV变异的血清学检测芯片的建立

材料和方法

一．实验材料

二 实验方法

实 验 结 果

1 丙型肝炎病毒第一高变区（HVR1）变异代表抗原组合的制备

2.多靶点检测芯片的制备及条件优化

讨 论

1、 蛋白芯片反应区的设计

2、 抗原点样浓度和荧光标记二抗对实验结果的影响

3、 HCV变异的结果确定

4、 蛋白芯片内质控血清的建立

小 结

第二部分 HCV变异检测技术的临床评价

材料和方法

1．实验材料

2实验方法

结果

1. HCV变异的血清学检测方法与克隆测序法之间相关性的比较

2. HCV感染不同阶段患者血清HVR1抗体异质性检测评价

3 IFN治疗HCV患者血清的HVR1抗体异质性结果评价

讨论

1. HCV感染者第一高变区及部分膜区序列变异的分子进化分析

2．HCV变异的多靶点血清学检测技术与克隆测序技术的比较

3. HCV变异的血清学检测结果与疾病转归之间关系的研究

4. HCV变异的血清学检测结果与IFN疗效之间关系的研究

小结

结论与展望

1.结论

2. 创新点：

参考文献

附录1：缩略词索引

附录2：文献综述

附录3：已发表文章

致谢

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