赤霉菌基因改造用于工程化组合产生紫杉烷类化合物的基础研究

摘要

紫杉醇(paclitaxel，商品名Taxol)是首先从太平洋红豆杉树皮中分离得到的有效抗肿瘤药物，属于紫杉烷二萜类化合物。在紫杉醇的生物合成途径中第一个重要的中间体是紫杉烯(taxa—4(5)，11(12)—diene)，它是由牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(Geranylgeranyl diphosphate，GGDP)在紫杉烯合酶(Taxadiene Synthase，TS)催化下环化而成。GGPP也是赤霉素等的生物合成前体，本论文以赤霉素产生菌赤霉菌(Gibberella fujkuroi)为实验材料，开展了与紫杉醇合成生物学相关的研究和探索。
　　 1.赤霉菌GGPP合酶基因的克隆
　　 以赤霉菌为材料，提取总RNA，根据GenBank的有关信息设计并合成引物，RT—PCR.方法获得赤霉菌GGPP合酶基因(cDNA)，并进行测序验证。
　　 2.紫杉醇生物合成基因双元表达载体的构建
　　 在本室现有载体的基础上，构建了含有紫杉烯合酶(TS)基因及潮霉素抗性(HmBr)基因的双元表达载体pAN—7—1/AN7112/TS/HmB。
　　 3.赤霉菌贝壳杉烯合酶(CPS/KS)基因取代载体的构建
　　 在本室现有的含有赤霉菌贝壳杉烯合酶(CPS/KS)基因的克隆载体pMD3036FM的基础上，构建了cps/ks基因取代载体pMD3036FM(e)HmB等，该载体含有来自贝壳杉烯合酶基因序列的同源交换臂以及中间插入的潮霉素抗基因表达框。
　　 4.cps/ks基因取代载体和紫杉烯合酶基因表达载体共转化赤霉菌的研究
　　 将cps/ks基因取代载体pMD3036FM(e)HmB与pITS1共转化赤霉菌N.920菌株，获得了近百株抗性转化子，对其中的部分转化子进行了进一步鉴定与筛选，获得10余株潮霉素抗性基因整合型转化子，其中1株(CHITS9)还携带紫杉烯合酶基因，但上述转化子中，尚未筛选到cps/ks基因取代菌株，还有一些转化子有待继续鉴定；含有紫杉烯合酶基因的转化子的次生代谢情况也有待深入研究。
　　 本研究为以后在赤霉菌中开展紫杉醇等合成生物学研究具有重要意义，有望通过提高GGDP的产率以及阻断赤霉素合成代谢途径，进一步提高紫杉烷二萜类化合物等的产率。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写符号说明

声明

第一章 前言

第二章 材料与方法(汇总)

1.材料

1.1 主要试剂

1.2 主要溶液及试剂配制

1.3 菌株与质粒

1.4 实验仪器

2.主要方法

2.1 大肠杆菌相关实验方法

2.2 赤霉菌相关实验

参考文献

第三章 相关载体的构建

1.实验方法

2.实验结果与讨论

第四章 重组质粒转化赤霉菌的初步研究

第一部分 重组紫杉烯合酶基因在赤霉菌中表达的初步研究

1.实验结果与讨论

第二部分 重组cps/ks基因取代载体转化赤霉菌的初步研究

1.实验结果与讨论

全文总结

综述：胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)的研究进展

参考文献

致谢

附图