以GPR40受体为靶点的细胞模型建立和唐顺平对高脂喂养C57小鼠胰岛素抵抗的改善作用及其机制探讨

摘要

随着饮食习惯和生活方式的改变,肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病的发病率迅猛增长,严重威胁着人们的身体健康和生活质量。现有口服降糖药物的副作用以及其治疗无效的病例不断增加,使得研发新型安全有效的抗糖尿病口服药物,成为药物研发攻关的焦点。GPR40是新近发现的G蛋白偶联受体家族成员,主要分布于胰腺β-细胞。研究证实GPR40是中、长链游离脂肪酸(FFAs)的受体,是介导FFAs的“增强葡萄糖刺激胰岛素分泌”作用的主要途径。激活GPR40受体,可以降低血糖,其优点是“糖依赖性”,较少或几乎不引起低血糖反应。因此,GPR40已逐步成为治疗糖尿病的新靶点之一,针对于该靶点的小分子GPR40激动剂的寻找已经成为国内外研发治疗2型糖尿病药物的新热点。本研究致力于建立以GPR40信号通路为靶点的药物筛选细胞模型,用于发现GPR40受体激动剂类的新型抗糖尿病药物。胰岛素抵抗是2型糖尿病、肥胖、心血管疾病以及动脉粥样硬化等多种代谢性疾病的共同病理生理基础。深入研究胰岛素抵抗发生发展的机理,寻找理想的胰岛素增敏剂已成为各国科研工作者关注的焦点。胰岛素抵抗病因复杂,中药复方多成分,多靶点的作用,在改善胰岛素抵抗方面有着极大的优势与潜力。唐顺平是本实验室在金芪降糖片的研究基础上提取各单味药(黄连、黄芪和金银花)的有效部位重新组成的复方,本文旨在观察其在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗动物模型的作用并探讨其可能的作用机制
　　 第一部分成功建构了以人源GPR40信号通路为靶点的HEK293细胞模型。首先利用基因工程重组技术构建相关质粒:人源GPR40蛋白跨膜表达质粒:Peak13-CD5L-hGPR40；受GPR40下游信号调控的hElk1激活结构域与Gal4 DNA结合结构域(DBD)融合蛋白表达质粒:pCMV-hElk1-Gal4-tag5A；以及6拷贝的Gal4应答元件调控的荧光素酶报告基因质粒:Peak12-6×Gal4-luci。然后,将三个质粒共转染HEK293细胞株,加入不同浓度的内源性、外源性GPR40激动剂,以验证该细胞模型对GPR40激动剂的反应性和特异性。结果显示,该细胞模型对GPR40的内源性配体--软脂酸以及人工合成GPR40小分子激动剂——GW9508的激活反应灵敏,具有特异性。目前,已将这种细胞模型用于GPR40激动剂筛选工作中,而进一步的优化工作也正在进行中,目的是使该细胞模型应用于高通量筛选。
　　 第二部分评价了唐顺平对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗动物模型的影响,并探讨其可能的作用机制。高热量、高脂饮食喂养雄性成年C57BL/6J小鼠(HF-C57)3-4月,可以诱发胰岛素抵抗。该模型具有明显肥胖、空腹血糖升高、血脂紊乱,同时伴有葡萄糖耐量异常,胰岛素耐量异常,高胰岛素血症等类似人类2型糖尿病的特征,是一种较为理想的具有人类胰岛素抵抗病理特征的动物模型,适用于寻找胰岛素增敏剂的开发研究。唐顺平可以明显改善模型动物的胰岛素抵抗症状:主要表现在能够改善胰岛素耐量异常、葡萄糖耐量异常,增加高血糖钳夹的葡萄糖输注速率,改善高胰岛素血症、增加胰岛素敏感指数。其可能通过降低体重,减少异位脂肪堆积,改善脂质代谢紊乱、降低血NO水平,改善HF-C57小鼠的胰岛素抵抗状态。肝组织AMPK的活化可能是其改善胰岛素抵抗的分子作用机理之一,而对相关靶组织IR、IRS-1、GLUT2、GLUT4等基因的表达水平未见明显增加。