抑制Kupffer细胞NF-κB介导的炎症通路改善C57/BL6小鼠追赶生长和高脂饮食所致胰岛素抵抗

摘要

目的：观察追赶生长和高脂饮食导致胰岛素抵抗的C57BL/6小鼠全身和主要胰岛素敏感性组织的胰岛素敏感性和炎症情况以及采用siRNA选择性阻断Kupffer细胞NF-κB活性的影响，探索Kupffer细胞IKKβ/NF-κB炎症通路在全身胰岛素抵抗发生过程中的作用。
　　方法：6周龄的雄性C57BL/6小鼠适应性喂养一周后，采用体重因素随机区组设计分为正常对照组（normal control group, NC,n=10），高脂饮食组(high fat diet group, HF,n=30)，追赶生长组(catch-up growth group, CH, n=30)。NC组给予普通饲料，自由摄食12周。HF组前四周给予普通饲料摄食，4周后给予高脂饲料自由摄食，在8周末，将HF组分为高脂饮食组（high fat diet induced insulin resistance group, HF, n=10），高脂饮食NF-κB p65siRNA干预组（high fat diet with NF-κB p65 siRNA intervention group, HFPS, n=10）和高脂饮食对照siRNA干预组（high fat diet with NC siRNA intervention group, HFNS, n=10）。CH组前四周给予NC组同体重小鼠进食量的50％，4周后给予高脂饲料自由摄食。在8周末，将CH组分为追赶生长组（catch-up growth induced insulin resistance group, CH, n=10），追赶生长NF-κB p65siRNA干预组（catch-up growth with NF-κBp65siRNA intervention group, CHPS, n=10）和追赶生长对照siRNA干预组（catch-up growth with NC siRNA intervention group, CHNS, n=10）。siRNA干预方式为尾静脉注射，每四天一次，共7次，每次注射15nmol/只。每日测定体重和进食量，分别于四周末、八周末和十二周末行IPGTT、ITT，测定血清胰岛素。通过计算IPGTT、ITT的曲线下面积和HOMA-IR反映系统胰岛素敏感性。Western法检测肝脏和骨骼肌的AKT和p-AKT以反映肝脏和骨骼肌的胰岛素敏感性。采用生化法测定血清中甘油三酯、游离脂肪酸和胆固醇，肝脏的甘油三酯，脂肪和腓肠肌的甘油三酯和脂肪酸含量。 ELISA法测定血清和组织（肝脏、脂肪和骨骼肌）的TNF-α，IL-6水平。RT-PCR法检测肝脏中巨噬细胞活化指标CD68，F4/80，CD11c的表达。ELISA法测定肝脏和脂肪的NF-κB p65活性。
　　结果：1：追赶生长小鼠和高脂饮食小鼠的体重明显增加(与NC组比较，分别增长7.8％和15.5％），主要表现为内脏型肥胖（与NC组比较，内脏脂肪/体重比分别增加100％和138％），并伴随血甘油三酯（p<0.01），游离脂肪酸（p<0.01）和胆固醇的升高。NF-κB p65 siRNA干预减轻胰岛素抵抗小鼠高脂饮食所致的体重增长（p<0.01）、明显改善内脏脂肪/体重比（CHPS组比CH下降21.4％，HFPS组比HF下降38％）和血脂水平（p<0.01）。
　　2：追赶生长小鼠和高脂饮食小鼠的肝脏甘油三酯含量增加（p<0.01），肝脏、内脏脂肪和骨骼肌的脂肪酸水平增加（p<0.01），肝脏的HE染色可见大量的脂滴沉积和炎症细胞浸润，表明追赶生长和高脂饮食组小鼠出现明显的脂质异位沉积。NF-κB p65 siRNA干预后，组织的脂质水平有明显下降（p<0.01），肝脏的脂滴沉积和炎症细胞浸润有所减少。
　　3：追赶生长小鼠和高脂饮食小鼠血清、肝脏、脂肪和骨骼肌的TNF-α、IL-6均明显升高（p<0.05）；肝脏 Kupffer细胞明显激活（p<0.001），以 M1型为主（p<0.05）；肝脏和脂肪组织中转录因子NF-κB活化明显增加（p<0.05）。经NF-κB p65干预后，循环和组织中的TNF-α和 IL-6水平明显下降（p<0.05），Kupffer细胞的激活受到抑制（p<0.001），肝脏和脂肪的NF-κB活化水平下降（p<0.05）。
　　4：追赶生长小鼠和高脂饮食小鼠随着高脂饮食时间的延长，全身系统性胰岛素敏感性下降（IPGTT、ITT曲线下面积增加,HOMA-IR值升高）,肝脏和骨骼肌出现明显的胰岛素抵抗（pAKT/AKT降低）。NF-κB p65 siRNA干预四周后，全身胰岛素敏感性以及肝脏和骨骼肌组织的胰岛素敏感性均有不同程度的改善。
　　结论：追赶生长和高脂饮食导致的胰岛素抵抗小鼠具有内脏型肥胖、血脂异常和胰岛素抵抗的表型特征。上述模型同时表现出肝脏和骨骼肌组织脂质异位沉积，循环和胰岛素敏感性组织中促炎因子TNF-α、IL-6增高。其肝脏Kupffer细胞促炎性活化增强，肝脏和骨骼肌的NF-κB被激活。采用siRNA靶向抑制Kupffer细胞NF-κB活性在减少Kupffer细胞活化、减轻肝脏炎症和胰岛素抵抗的同时遏制内脏型肥胖的进展并改善全身的炎症状态和胰岛素抵抗。提示Kupffer细胞IKKβ/ NF-κB炎症通路激活在追赶生长和高脂饮食诱导产生胰岛素抵抗的过程中担任了重要角色。靶向抑制Kupffer细胞的NF-κB通路可能成为筛选治疗胰岛素抵抗和T2DM药物的新途径。

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1 绪 言

2 材料方法

2.1 实验材料

2.2 实验器材

2.3 实验方法

3 实验结果：

3.1 小鼠一般指标

3.2 脂质异位沉积

3.3胰岛素敏感性指标

3.4 循环和组织中的炎症因子TNF-α和IL-6的水平

3.5 Kupffer细胞激活水平的变化

3.6 肝脏和脂肪转录因子NF-κB的活化水平

4 讨论

4.1追赶生长和高脂饮食导致的胰岛素抵抗小鼠具备内脏型肥胖、脂质异位沉积、Kupffer细胞活化增加、全身性炎症和胰岛素抵抗的特征

4.2 NF-κB激活介导追赶生长和高脂饮食小鼠产生胰岛素抵抗

4.3 胰岛素抵抗治疗的新途径

参考文献

综述

参考文献

致谢