M2型丙酮酸激酶(PKM2)的相关研究——TCRγδ配体或肿瘤生物标志物的鉴定

摘要

γδT细胞受体(TCRγδ)所识别的配体至今仅有较少的被鉴定。近年来,我们实验室利用TCRδ链互补决定区3(CDR3δ)多肽结合实验体系成功发现和鉴定了一些TCRγδ新配体,为全面阐明γδT细胞功能奠定了结构基础。
　　 M2型丙酮酸激酶(PKM2)是本课题组前期以OT3肽(来自卵巢癌γδTIL的CDR3δ的一个优势序列)为探针,从卵巢癌细胞蛋白提取液中筛选到的蛋白之一,在肿瘤细胞中有高水平表达。本研究的第一部分是采取多种方法对PKM2的结合特性、细胞定位及其对γδT细胞的刺激活性检测进行了初步研究,以确定其是否为TCRγδ的新配体。
　　 我们采用Western blot的方法验证与PKM2结合；用Westernblot及免疫组化的方法观察PKM2在肿瘤细胞及组织中的表达；用流式细胞术及激光扫描共聚焦显微镜术的方法验证PKM2在肿瘤细胞的定位；用固相化PKM2体外扩增γδT细胞和PKM2刺激γδT。细胞分泌IFN-γ的实验,检验PKM2的功能。实验结果表明:PKM2可与OT3肽结合,肿瘤细胞总蛋白提取物中含有大量PKM2,提示以OT3为探针,从肿瘤细胞总蛋白提取物中钓取到PKM2是合理的,用此方法筛选OT3结合蛋白的方法是可行的；PKM2普遍表达于肿瘤细胞及组织,但不表达于肿瘤细胞膜；PKM2在体外不能扩增γδT细胞,无刺激γδT细胞产生IFN-γ的功能。提示,PKM2不表达于肿瘤细胞表面,对γδT细胞不具有刺激活化的功能,PKM2不具备TCRγδ配体的特性。但免疫组化检测结果显示PKM2在肾癌、直肠癌和肺癌有高表达,提示其有成为肿瘤生物标记物的临床价值。
　　 本研究第二部分工作是制备PKM2的单克隆抗体,以期为验证PKM2为肿瘤标记物提供必要的试剂。
　　 我们以原核表达的rhPKM2蛋白为免疫原,免疫BALB/C小鼠,用ELISA法检测小鼠血清中抗体的效价；用杂交瘤技术,取免疫小鼠的脾细胞,与SP20进行细胞融合；用甲基纤维素半固体HAT培养基法培养融合后的杂交瘤细胞,用ELISA法筛选出阳性克隆,用Western blot法鉴定其结合特异性,用Rrotein G亲和层析株纯化单抗,并与HRP偶联,进而探索定量检测PKM2 ELISA试剂盒的制备。结果我们成功制备出了PKM2的多株单抗,有三株可用于Western blot实验,随后成功生产纯化并用HPR标记了两株单抗(5-G10和4-D10),进而,进行了双抗体夹心ELISA方法检测PKM2的实验,结果表明有阳性结合反应。本研究为后续研发定量检测PKM2的ELISA试剂盒奠定了基础。